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干貨 | WB 實驗中的關(guān)鍵控制點和注意事項

欄目：技術(shù)支持
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滿懷期待跑 WB，拍照后卻發(fā)愁了，條帶怎么這么弱？這種時候，相信很多小伙伴都百思不得其解，除了發(fā)問“條帶去哪了”，還一度相信 WB 就是門玄學(xué)。長此以往，大家面對 WB 實驗似乎都抱有“心誠則靈”的無力態(tài)度，萬一成功了呢？

玩笑歸玩笑，言歸正傳，面對不好拿下的 WB 實驗，“心誠則靈”是有道理的?！靶恼\”的意思是，面對失敗的實驗我們有必要用心逐一排查問題所在，優(yōu)化實驗體系。總而言之在繁瑣復(fù)雜的 WB 面前，沒有任何捷徑。

本期的干貨課堂我們就來重點探討 WB 實驗中的一些關(guān)鍵控制點，并提供實用的 Tips 供大家參考。

WB 實驗步驟


WB 實驗中的關(guān)鍵控制點和注意事項

Key Points about WB


一

WB 樣本的制備


1

將樣品置于冰上或者維持在 4℃ 下


2

選擇合適的抑制劑


抑制劑推薦


蛋白酶抑制劑

在細(xì)胞破裂蛋白抽提的過程中，這些蛋白酶也會被一起釋放出來，混入蛋白樣品中，對蛋白樣品造成降解



磷酸酶抑制劑

*（檢測磷酸化條帶時必須要添加）

磷酸酶機(jī)理：通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團(tuán)除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基

二

選擇合適的蛋白定量方法


1

進(jìn)行 Bradford 分析、Lowry 分析或二喹啉甲酸 (BCA) 分析


2

通常使用牛血清蛋白 (BSA) 作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品

三

WB 電泳分離


1

用還原及變性的緩沖液 (e.g. Laemmli buffer)將蛋白變性，準(zhǔn)備上樣

使多肽帶上負(fù)電荷

使蛋白變性并將多肽拉直

將二硫鍵打斷

使抗原表位暴露出來


2

凝膠上樣

20-40 μg 全細(xì)胞裂解液或 100 ng 純化蛋白

每條泳道上相同蛋白量

根據(jù)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量優(yōu)化上樣量


3

分離膠選擇 Tips（FuturePAGE蛋白預(yù)制膠）

分子量 4-40 kDa，分離膠濃度 20％

分子量 12-45 kDa，分離膠濃度 15％

分子量 10-70 kDa，分離膠濃度 12.5％

分子量 15-100 kDa，分離膠濃度 10％

分子量 25-200 kDa，分離膠濃度 8％

四

WB 的蛋白轉(zhuǎn)膜

電泳結(jié)束后，凝膠(帶有已分離的蛋白)與膜緊貼放置，使用電流把蛋白從凝膠轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后可用麗春紅進(jìn)行可逆轉(zhuǎn)色判斷轉(zhuǎn)移效果。

1

膜的類型

硝酸纖維素膜（NC 膜），韌性差，低背景

Polyvinylidene Difluoride (PVDF 膜轉(zhuǎn)印包)，甲醇激活，蛋白結(jié)合力強(qiáng)

2

轉(zhuǎn)膜 Tips

對于分子量較大的靶蛋白，推薦在轉(zhuǎn)膜緩沖液中加入 SDS 至終濃度為 0.1％；對于分子量較大的靶蛋白，推薦在轉(zhuǎn)膜緩沖液中使用 10％ 或者更低濃度的甲醇；對于分子量較小的靶蛋白，推薦在轉(zhuǎn)膜緩沖液中使用 20％ 甲醇

對于分子量較大的靶標(biāo)蛋白，建議使用 0.45 μm 的 PVDF 膜；對于分子量較小的靶標(biāo)蛋白，建議使用 0.22 μm 的 PVDF 膜


五

WB 的封閉處理


膜封閉處理可降低一抗/二抗的非特異性結(jié)合。



常用的封閉劑


5% 脫脂奶粉 in TBST

5% BSA in TBST

六

抗體孵育


1

一抗特異性地檢測目標(biāo)蛋白

一抗室溫孵育 1-2 h 或 4 ℃ 過夜孵育

選用適合的一抗工作濃度或稀釋度

一抗可以用封閉液來稀釋

WB 信

2

二抗辨認(rèn)一抗的恒定區(qū)

（具有物種特異性）


二抗室溫孵育 1-2 h

選用適合的二抗工作濃度或稀釋度，一般工作濃度要低于一抗

二抗可以用封閉液來稀釋

二抗帶有標(biāo)簽


七

WB 的信號檢測



檢測方法分為化學(xué)發(fā)光檢測和熒光檢測。


號檢