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干貨 | DNA 在瓊脂糖凝膠中的遷移速率受哪些因素影響？

欄目：技術(shù)支持
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跑電泳是分子生物學(xué)實驗的一項基本技術(shù)。而瓊脂糖凝膠電泳作為生物學(xué)實驗中最常用的技術(shù)之一，其主要特點有哪些？DNA 在瓊脂糖凝膠中的遷移速率又受什么因素影響呢？


今天，就來為大家做詳細(xì)的解讀與探討！準(zhǔn)備好迎接滿滿的干貨吧~

瓊脂糖凝膠電泳


瓊脂糖作為凝膠電泳常用支持物，其純度會直接影響DNA的分辨能力及電泳結(jié)果的清晰度。

MonTrack? Agarose瓊脂糖是標(biāo)準(zhǔn)熔點瓊脂糖，專為常規(guī)分離分析而設(shè)計，可分離50~15,000 bp范圍內(nèi)的DNA和RNA 片段。

MonTrack? High Gel Strength Agarose與高純度瓊脂糖相比，分離范圍相同，硬度提高33%，制膠厚度低至3~4mm時仍能夠保持凝膠的完整性。


高純度瓊脂糖(ME00101) /高硬度瓊脂糖(ME00201)


我們知道，瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定 DNA、RNA 的方法，這種

電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用 DNA 分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。
DNA 分子在高于其等電點的溶液中帶負(fù)電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA 分子的遷移速度與其相對分子量成反比。
不同構(gòu)型的 DNA 分子的遷移速度不同。如環(huán)形 DNA 分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：共價閉合環(huán)狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環(huán)分子(ocDNA)、和線形 DNA 分子(IDNA)。這三種不同構(gòu)型分子進(jìn)行電泳時的遷移速度大小順序為：cccDNA＞IDNA＞ocDNA。
核酸分子是兩性解離分子，pH 3.5 是堿基上的氨基解離，而三個磷酸基團(tuán)中只有一個磷酸解離，所以分子帶正電，在電場中向負(fù)極泳動；而 pH 8.0-8.3 時，堿基幾乎不解離，而磷酸基團(tuán)解離，所以核酸分子帶負(fù)電，在電場中向正極泳動。不同的核酸分子的電荷密度大致相同，因此對遷移速率影響不大。在中性或堿性時，單鏈 DNA 與等長的雙鏈 DNA 的遷移速率大致相同。

那么，DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速率會受哪些因素影響呢？



DNA 在瓊脂糖凝膠中的遷移速率：

影響因素有哪些？



1

通過凝膠的電流

根據(jù)歐姆定律 V = IR 式中, V 是電壓; I 是電流（單位安培）; R 是電阻（單位歐姆）。因為用于電泳的緩沖液通常是微堿性的（pH 7.8~8.0），通過凝膠的 DNA 分子攜帶負(fù)電荷，并以所施加的電流形成的速率向陽極遷移。


2

DNA 分子的大小

雙鏈 DNA 分子在凝膠基質(zhì)遷移的速率與其堿基對數(shù)的常用對數(shù)( log10 )成反比（Helling et al. 1974）。大分子 DNA 摩擦阻力大，通過凝膠孔徑的效率低于小分子 DNA ，因此遷移速率慢。


3

瓊脂糖濃度

瓊脂糖凝膠是由氫鍵和疏水作用聚合在一起的多孔膠體。在電流的作用下，DNA 線性分子通過一系列孔徑泳動，這些孔徑的有效直徑取決于凝膠中瓊脂糖的濃度（如下圖所示）。

在 DNA 電泳遷移率(μ)的對數(shù)和凝膠濃度 (ι) 之間存在線性關(guān)系，這種相關(guān)性可以用方程式來表示：
logμ= logμ0-Kr 
式中, μ0 是 DNA 自由電泳遷移率， Kr 是阻滯系數(shù)，是一個與凝膠性質(zhì)、遷移分子大小和形狀相關(guān)的常數(shù)。


4

DNA 的構(gòu)象

超螺旋環(huán)狀（Ⅰ型）、切口環(huán)狀（Ⅱ 型）和線性（Ⅲ 型） DNA 在瓊脂糖凝膠中遷移速率不同（Thorne 1996，1967）。

上述三種類型 DNA 的相對遷移率主要取決于瓊脂糖凝膠的濃度和類型，但是同時，電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度、以及Ⅰ型超螺旋 DNA 的絞緊程度或密度也都影響相對遷移率（ Johnson and Grossman 1977）。
在一些條件下，Ⅰ型 DNA 比 Ⅲ 型 DNA 遷移得更快；在另一些條件下，順序可能顛倒。絕大多數(shù)情況下，區(qū)分不同構(gòu)象 DNA 的最佳方式是在電泳系統(tǒng)中加入未處理的環(huán)狀 DNA 樣品和在單一限制酶切位點經(jīng)酶切消化后的同一線狀 DNA 樣品。


5

凝膠和電泳緩沖液中的染料

染料插入雙鏈 DNA 造成其負(fù)電荷減少，而剛性和長度增加。因此,線狀 DNA-染料復(fù)合物在凝膠中的遷移率約降低15%（ Sharp et al.1975）。


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6

施加電壓

低電壓時，線狀 DNA 片段遷移率與所用的電壓成正比。但是，電場強(qiáng)度升高時，高分子質(zhì)量 DNA 片段的遷移率不成比例增加。所以，當(dāng)電壓增大時，瓊脂糖凝膠分離的有效范圍反而減小。要獲得大于2kb DNA 片段的良好分辨率，則所用電壓不應(yīng)高于5~8 V/cm。


7

瓊脂糖種類

常見的瓊脂糖主要有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點瓊脂糖（ Kirkpatrick 1990），正在研制的第三種是熔點和凝點介于上述二者之間的瓊脂糖，它兼有兩者的特性。



8

電泳緩沖液

DNA 的泳動受電泳緩沖液的組成和離子強(qiáng)度的影響。缺乏離子（如用水替代電冰槽及凝膠中的緩沖液）則電導(dǎo)率降至很低。DNA 遷移極慢，或者完全不動。高離子強(qiáng)度時，如錯用了10×電泳緩沖液，電導(dǎo)率升高,即使應(yīng)用適中的電壓也會產(chǎn)生大量的熱量。最嚴(yán)重時凝膠會熔化，DNA 會變性。



如何選擇電泳緩沖液


 

有幾種緩沖液適用于天然雙鏈 DNA 的電泳,它們包括 Tris -乙酸鹽和 EDTA 緩沖液（pH 8.0， TAE ,也稱為 E 緩沖液）、Tris -硼酸鹽和 EDTA 電泳緩沖液（ TBE ）或 Tris -磷酸鹽和 EDTA 電泳緩沖液（TPE ），工作濃度約50mmol/ L ，pH 7.5~7.8。各種電泳緩沖液通常配制成濃溶液于溫室存放（見每種實驗方案后的配方）。這些緩沖液都非常有效，選擇哪一種使用主要看個人工作習(xí)慣。

 

三者之中 TAE 的緩沖容量最低，如長時間電泳會被消耗。此時凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化，凝膠中向陽極遷移的溴酚藍(lán)的顏色呈現(xiàn)從藍(lán)紫色到黃色的變化。該顏色變化從pH 4.6開始，到pH 3.0終止。定期更換緩沖液或調(diào)換兩個電極池的緩沖液可以防止 TAE 的消耗。TBE 和 TPE 比 TAE 花費(fèi)稍貴些，但是它們有高得多的緩沖容量。

 

雙鏈線狀 DNA 片段在 TAE 中比在 TBE 或 TPE 中遷移速率快10%左右。對于高分子質(zhì)量 DNA ，TAE 的分辨率高于 TBE 或 TPE ；對于低分子質(zhì)量 DNA ，TAE 要差些。此差別也許解釋下述現(xiàn)象：高度復(fù)雜混合物中的 DNA 片段，如哺乳類動物 DNA ,用 TAE 電泳可有較高分辨率。因此，用于分析復(fù)雜基因組的 Southern 印跡( Southern blot )均用 TAE 作為電泳緩沖液制備凝膠和電泳。超螺旋 DNA 在 TAE 中的電泳分辨率要好于 TBE 。