Benzonase全能核酸酶

產(chǎn)品簡介：

Benzonase全能核酸酶是一種來源于粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)的非特異性核酸內(nèi)切酶，可在非常寬泛的條件下降解單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀、天然或變性等各種形式的DNA 或RNA，產(chǎn)生長度為3至5個堿基的5'-單磷酸寡核苷酸。本產(chǎn)品用途廣泛，常用于重組蛋白、病毒疫苗等生物制品中去除核酸，以及有效降低細胞、組織、微生物等蛋白裂解液樣品的粘度等。
    本產(chǎn)品為超純級，純度≥99%，無蛋白酶活性，內(nèi)毒素極低，Benzonase全能核酸酶，又稱廣譜核酸酶，與Benzonase endonuclease、TurboNuclease等類似酶的氨基酸序列基本一致(主要是蛋白的氨基端或羧基端所帶的標簽或殘留氨基酸序列略有不同)，具有同樣的酶催化活性和相同的用途，大多數(shù)情況下可以相互替代。具體使用時，需要注意純度和內(nèi)毒素水平對于后續(xù)分析檢測的影響。

產(chǎn)品信息：

 保存條件: 

20oC保存，三年有效。4oC保存，至少兩個月內(nèi)有效。

適用范圍：

Benzonase全能核酸酶需1-2mM Mg²⁺作為輔助因子促進其酶活性，最適范圍(Optimal Range, Enzyme Activity >90%)和有效范圍(Effective Range, Enzyme Activity >15%)見下表。

在最適反應條件下，Benzonase全能核酸酶對于不同樣品的推薦用量和處理時間請參考下表。注：實際用量和處理時間 需根據(jù)樣品的實際情況進行一定的摸索，若使用的溶液較為特殊，如為高鹽溶液，或偏酸性、偏堿性，或含有較高濃度的去垢劑、變性劑等，應適當增加Benzonase全能核酸酶的用量或孵育時間。

使用說明：
1. 用于降低細胞、組織或細菌裂解液的粘度。
a. 對于培養(yǎng)細胞樣品：

(a) 對于貼壁細胞：吸除細胞培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。每1ml RIPA裂解液、Western及IP細胞裂解液或其它細胞裂解液中加入0.1-1μl Benzonase全能核酸酶，然后按照裂解液的使用說明用于貼壁細胞的裂解。加入含有Benzonase全能核酸酶的裂解液后，冰浴或室溫孵育5-30分鐘，收集裂解液，10,000-14,000×g離心3-5分鐘，取上清，即可用于后續(xù)的 PAGE、Western和免疫沉淀等實驗。

(b) 對于懸浮細胞：250-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白 沒有干擾，可以不洗)，再離心收集細胞，輕輕vortex或者彈擊管底以把細胞盡量分散開。如果細胞量較多，必須分裝成50-100萬細胞/管，然后再用于后續(xù)的裂解。每1ml RIPA裂解液、Western及IP細胞裂解液或其它細胞裂解液中加入0.1-1μl本Benzonase全能核酸酶，然后按照裂解液的使用說明用于貼壁細胞的裂解。加入含有Benzonase全能核酸酶的裂解液后，冰浴或室溫孵育5-30分鐘，10,000-14,000×g離心3-5分鐘，取上清，即可用于后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等實驗。

裂解液用量說明：通常6孔板每孔貼壁細胞或每100萬動物細胞加入100微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高或者細胞比較大的情況，可以適當加大裂解液的用量到150-250微升。

b. 對于組織樣品：

(a) 把組織剪切成細小的碎片。

(b) 按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入RIPA裂解液、Western及IP細胞裂解液或其它細胞裂解液，同時加入0.1-1μl本Benzonase全能核酸酶。

(c) 用玻璃勻漿器勻漿，或使用研磨儀進行研磨，直至充分裂解。也可以把組織樣品冷凍后液氮研磨，研磨充分后加入裂解液進行裂解。

(d) 充分裂解后，冰浴或室溫孵育5-30分鐘，10,000-14,000×g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

(e) 如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器或研磨設備，缺點是不如勻漿或研磨那樣裂解得比較充分。

c. 對于細菌或酵母樣品：

(a) 對于1ml菌液或酵母液，離心去上清，如果有必要可以使用PBS洗滌一次，充分去除液體后，輕輕vortex或者彈擊管底以把細菌或酵母盡量彈散。加入100-200微升RIPA裂解液或其它細胞裂解液，同時加入0.1-1μl Benzonase全能核酸酶。

(b) 輕輕vortex或者彈擊管底以混勻，冰浴或室溫孵育5-30分鐘，。如果希望獲得更好的裂解效果，細菌和酵母可以分別使用溶菌酶和破壁酶(Lyticase)消化，然后再使用裂解液進行裂解。

2. 去除重組蛋白中的核酸：

重組蛋白生產(chǎn)時對核酸殘留有嚴格的要求，很多情況可以參考如下描述以去除殘留的核酸。生物樣品中DNA濃度范圍通常在0.5-5μg/ml之間，如下采用高負荷DNA濃度50μg/ml的鯡魚精子DNA溶液進行的測試，反應緩沖液為50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM MgCl2, 0.1 mg/ml BSA。

a.  37oC反應22h，反應液中Benzonase全能核酸酶終濃度為90U/ml時，可降解所有DNA；反應液中Benzonase全能核酸酶終濃度為9U/ml時，可降95%的DNA；

b.  反應液中Benzonase全能核酸酶終濃度為90U/ml時，23oC反應30h可降解所有DNA；0oC反應30h可降解99%的DNA；

c.  樣品在10mM Tris (pH8.0)緩沖液中，反應液中Benzonase全能核酸酶終濃度為90U/ml時，23oC反應22h可降解所有DNA；樣品在PBS緩沖液中，反應液中Benzonase全能核酸酶終濃度為90U/ml時，23oC反應30h可降95%的DNA。

3. 去除重組病毒中的核酸：

對于在細胞中包裝生產(chǎn)的重組病毒，在收集的細胞上清中直接加入Benzonase全能核酸酶，使之終濃度約為1U/ml，30 34oC反應4-8h，即可有效地將宿主細胞的核酸(DNA及RNA)降解為3-5bp的核酸片段。

4. 實時定量PCR法測定重組病毒滴度時去除核酸干擾：

在檢測重組病毒滴度時，Benzonase全能核酸酶可以去除病毒上清中基因組DNA、RNA和質(zhì)粒等核酸干擾，通過在載體的長末端重復序列區(qū)(LTR)設計引物，利用熒光實時定量PCR測定重組病毒中LTR拷貝數(shù)來測定病毒顆粒數(shù)。建議在PCR管 中按照下表體系進行設置，37oC孵育30min去除核酸后，再對樣品進行梯度稀釋并實時定量PCR檢測。Benzonase全能核酸酶終濃度1-5U/ml，Reaction Buffer: 10mM Tris pH8.0, 2mM MgCl2, 0.1% PEG8000, 0.1mg/ml BSA.

5. 防止細胞成團：

Benzonase全能核酸酶加入細胞培養(yǎng)液中可以防止細胞成團，特別是在解凍細胞時。例如全血分離的外周血單核細胞 (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)解凍后易聚集在一起，影響后續(xù)分析和檢測。如果在PBMCs凍存液中加入終濃度為50U/ml的Benzonase全能核酸酶可以有效防止細胞成團。Benzonase全能核酸酶不僅沒有蛋白酶的活性，而且不會對健康細胞造成傷害，因此是防止細胞成團的理想選擇。

6. 降低大腸桿菌裂解液粘度，改善純化過程中離心難、過濾難的問題：

大腸桿菌高密度發(fā)酵在增加菌密度的同時提高了重組蛋白的表達量，但是大腸桿菌破碎后釋放的基因組DNA會導致裂解液粘度大，加大了離心和澄清過濾的難度。

按照0.2g濕菌用1ml細菌裂解液重懸菌體，使用高壓破碎儀1500bar，4oC進行均質(zhì)破碎。如果加入終濃度為25U/ml的Benzonase全能核酸酶，15oC反應15min，與不加Benzonase全能核酸酶的細菌裂解液相比粘度降低50%；如果加入終濃度為2.5U/ml Benzonase全能核酸酶，15oC反應30min，與不加Benzonase全能核酸酶的細菌裂解液相比粘度降低37%。

采用混纖膜(MCE)和聚醚砜膜(PES)，孔徑分別為0.4μm和0.8μm的濾膜進行澄清測試，不加Benzonase全能核酸酶的細菌裂解液幾乎立即堵塞了濾膜，而終濃度為25U/ml的Benzonase全能核酸酶處理過的細菌裂解液，在過濾時間為20s 后，0.8μm孔徑的膜通量可以達到7400L/m2h，0.45μm孔徑的膜通量可以達到4200L/m2h。對于孔徑較小的0.22μm濾膜，即使在用25U/ml Benzonase全能核酸酶消化后，過濾時也會立即發(fā)生堵塞，如果一定需要使用0.22μm濾膜過濾細菌裂解 液，建議先用聚醚砜膜(PES)材質(zhì)0.45μm孔徑的濾膜過濾后再用0.22μm濾膜過濾，或者需要加大酶的用量或延長孵育時間。

7. 提高包涵體蛋白復性率：

在大腸桿菌中以包涵體形式表達重組蛋白的方法，因其表達量高、蛋白純度高、免受蛋白酶降解和可表達對宿主細胞有毒的蛋白而廣泛應用。在包涵體蛋白變性后復性，即重折疊的過程中，由于細菌裂解液中大量的DNA可能會粘附蛋白酶，導致目的蛋白的降解，如果在細菌裂解液中加入終濃度為1U/ml Benzonase全能核酸酶，37oC反應30min，即可有效降低由于基因組DNA而粘附的蛋白酶，提高包涵體的純度，最終提高包涵體蛋白復性率。

8. 二維凝膠電泳樣品的制備：

二維凝膠電泳用于分離復雜的蛋白質(zhì)混合物，分辨率高。核酸是帶負電荷的分子，可以與蛋白質(zhì)表面帶正電荷的區(qū)域相互作用形成復合物，這種核酸-蛋白質(zhì)復合物的形成和形狀很難預測。與純蛋白質(zhì)相比，這些核酸-蛋白質(zhì)復合物在電場中的 遷移方式不同，可能會導致蛋白質(zhì)條帶偏移，使二維凝膠電泳的分辨率差。如果按照每100μl細胞裂解液加入50U的 Benzonase全能核酸酶對樣品進行預處理，可減少水平條紋，顯著提高二維凝膠電泳分離的分辨率。另外，因為所需酶量較少，所以無需擔心Benzonase全能核酸酶的使用對二維凝膠電泳的結(jié)果的影響。

注意事項：

1.     本產(chǎn)品不建議-80oC保存，凍融可能會降低本產(chǎn)品的酶活性。

2.     Mg²⁺是Benzonase全能核酸酶的關(guān)鍵催化輔助因子，反應緩沖液含有1-2mM Mg2+對Benzonase全能核酸酶的活性是必須的。

3.     參照最適范圍和有效范圍表格，若使用的溶液較為特殊，如為高鹽溶液，或偏酸性、偏堿性，或含有較高濃度的去垢劑、變性劑等，應適當增加Benzonase全能核酸酶的用量或孵育時間。

4.     本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

5.     為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

1.     在使用過程中，應在哪一步加入Benzonase全能核酸酶？

如果“使用說明”中沒有相應的操作，一般是在培養(yǎng)后、捕獲樣品步驟之前添加。

2.     在低溫條件下，應在加入多少Benzonase全能核酸酶？

溫度低于37oC時，BeyoZonase?超級核酸酶的效率會降低，通常情況下，在不增加Benzonase全能核酸酶使用量的情況 下，可以通過延長孵育時間來補償?shù)蜏貢r的酶切效率低。

3.     為什么Benzonase全能核酸酶不起作用？什么會抑制Benzonase全能核酸酶的活性？

Benzonase全能核酸酶在很寬泛的條件下都有酶活性，但是Mg²⁺是Benzonase全能核酸酶的關(guān)鍵催化輔助因子，反應液含有1-2mM Mg²⁺對Benzonase全能核酸酶的酶活性是必須的。Mn²⁺可以替代Mg²⁺，但是只有在Mg²⁺存在的情況下， 酶才能達到最佳的活性。如果陽離子濃度>300mM、磷酸鹽濃度>100mM、硫酸銨濃度>100mM或者>1mM EDTA的情況下，Benzonase全能核酸酶的酶活性會受到抑制。

4.     為什么Benzonase全能核酸酶的酶活性下降？

通常來說Benzonase全能核酸酶是十分穩(wěn)定的，在極少數(shù)情況下酶活性下降。不可逆的酶失活可能是由于樣品中存在變 性劑、蛋白酶或者-80oC凍融；可逆的酶失活可能是因為存在螯合劑(如EDTA)或去除了Benzonase全能核酸酶的關(guān)鍵催化輔助因子Mg²⁺。

5.     如何抑制Benzonase全能核酸酶的酶活性？

在陽離子濃度>300mM、磷酸鹽濃度>100mM、硫酸銨濃度>100mM或者>1mM EDTA的情況下，Benzonase全能核酸酶的酶活性會受到抑制，但這些都是可逆的酶失活。只有在極端條件下(100mM NaOH，70oC處理30min)才能實現(xiàn)不可逆的酶失活。

6.     Benzonase全能核酸酶是否具有蛋白酶活性？

否。Benzonase全能核酸酶沒有檢測到蛋白酶活性，因此在其“工作”期間不會降解目的蛋白。但是如果樣品中存在蛋白酶，可能會導Benzonase全能核酸酶的不可逆降解。

7.     Benzonase全能核酸酶是否與蛋白酶抑制劑兼容？

是。但是，由于許多蛋白酶抑制劑中含有EDTA，而>1mM EDTA的情況下Benzonase全能核酸酶的酶活性會受到抑制， 因此應謹慎使用。