R-Phycoerythrin (PE) 藻紅蛋白

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

R-藻紅蛋白（PE）是從紅藻中分離出來的。其主要吸收峰位于565nm，次要吸收峰位于496和545nm。不同類型的R-PE之間次級(jí)峰的相對(duì)突出程度存在明顯差異。PE有三種類型的亞基：α（20000daltons）、β（20000daltons）和γ（30000daltons），PE的α亞基僅含有藻紅蛋白（PEB）發(fā)色團(tuán)，而β和γ亞基同時(shí)含有PEB和藻膽蛋白（PUB）。不同類型PE吸收光譜的可變性反映了亞基PEB/PUB比值的差異。PE和與B-PE是最強(qiáng)烈的熒光藻膽蛋白，量子效率可能超過90%，在任何中等濃度的溶液中，其橙色熒光都很容易被肉眼看到。

通常，當(dāng)作為硫酸銨沉淀物冷藏儲(chǔ)存時(shí)，藻膽蛋白具有良好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。純化的膽脂蛋白可以在酸性或堿性條件下解離成亞基，但在室溫下在中性pH下相對(duì)穩(wěn)定，濃度大于0.1mg / mL。解離的亞基通常比天然色素的著色和熒光更低。建議將所有藻膽蛋白及其結(jié)合物（優(yōu)選在中性緩沖溶液中）冷藏保存。

產(chǎn)品特性：

1）分子量：約240000

2）溶劑：水

3）Ex/Em：565/575

保存條件: 

4℃避光干燥保存，1年有效。

產(chǎn)品使用：（僅供參考）

PE與抗體的綴合實(shí)驗(yàn)方案

注1：整個(gè)綴合過程可以在一天內(nèi)完成。但是，綴合前對(duì)PE的純化可能需要24-48小時(shí)。除了下面列出的材料外，您還需要濃度至少為2 mg/ml 的抗體溶液。請(qǐng)您在進(jìn)行PE抗體綴合實(shí)驗(yàn)之前熟悉如何使用脫鹽柱以及如何獲取吸光度光譜。

注2：SMCC-PE綴合物非常穩(wěn)定（在“交換緩沖液”中，在 4℃下至少可以穩(wěn)定幾個(gè)月）。因此，如果您需要節(jié)省一部分時(shí)間，可以選擇同時(shí)綴合10毫克或更多的PE，并將其用于幾次抗體實(shí)驗(yàn)（在幾周內(nèi)）。SMCC-PE 的長(zhǎng)期儲(chǔ)存最好是作為飽和硫酸銨沉淀物。

一. PE的制備

1. 將PE純化。綴合前的濃度通常為 5-10 mg/ml。注意：PE在綴合前作為SAS（硫酸銨鈉）沉淀物最穩(wěn)定。如果將PE以SAS沉淀物的形式儲(chǔ)存，則必須在使用前進(jìn)行大量純化。

2. 使用3.5毫克R-PE修飾每毫克IgG，包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。

3. 檢查PE的純度和濃度，請(qǐng)測(cè)量 280、565 和 620 nm 處的吸光度。（1 mg/ml的PE在 565nm處的OD為 8.2）。565/620 比率 > 50 表示已充分去除污染的藻藍(lán)蛋白；565/280 比率 > 5 表示已充分去除所有其他蛋白質(zhì)。

二. PE的活化

1. 使用前在無水DMSO中制備10 mg/ml的SMCC 儲(chǔ)備溶液。

2. 每毫克PE加入11 μl SMCC，并進(jìn)行渦旋。將反應(yīng)管用鋁箔包好，室溫下旋轉(zhuǎn) 60 分鐘。

3. 將純化的PE過凝膠過濾柱來交換緩沖液。

注意：對(duì)于失敗或效果較差的結(jié)合，增加或減少SMCC 相對(duì)于PE的量，可能會(huì)有所好轉(zhuǎn)。

三. IgG還原

1. 在蒸餾水中制備1M DTT (15.4 mg/100 μl) 的新鮮溶液。

2. IgG溶液濃度應(yīng)為4 mg/ml 或更高，這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進(jìn)行；MES、磷酸鹽和TRIS緩沖液（pH范圍為6至8）已被驗(yàn)證可以使用。如果抗體濃度低于2 mg/ml，則應(yīng)濃縮。緩沖液交換柱上的損失應(yīng)額外增加10%。

3. 用DTT配制20 mM IgG溶液：每毫升IgG溶液加入20 μl DTT 原液并攪拌。室溫下靜置 30 分鐘，無需額外攪拌（以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸）。

4. 將還原的IgG通過預(yù)平衡的“交換緩沖液”過濾柱。收集0.25毫升的級(jí)分，測(cè)定蛋白濃度，并將含有大部分IgG的級(jí)分匯集在一起?？梢酝ㄟ^分光光度法或比色法完成。

5. 此步驟后盡快進(jìn)行綴合。

注意：對(duì)于結(jié)合較差或失敗的情況，降低DTT濃度可能會(huì)有所幫助。

四. 進(jìn)行綴合

1. 每毫克IgG添加3.2毫克SMCC-PE。用鋁箔包裹反應(yīng)管并在室溫下旋轉(zhuǎn)60分鐘。

注意：這些摩爾比（每IgG約2個(gè)PE）效果很好。對(duì)于失敗或效果不佳的結(jié)合，不同的摩爾比可能會(huì)有所幫助。

2. 60分鐘后，必須去掉IgG上未反應(yīng)的游離巰基。

3. 在1.0 ml無水DMSO中制備10 mg NEM的新鮮溶液。

4. 每毫克 IgG 添加34 μg (3.4 μl)。室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20分鐘。

注意事項(xiàng)：

1.      熒光染料都存在淬滅問題，操作或保存過程中盡量避光，減緩熒光淬滅。

2.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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