新型鈣離子熒光探針Calbryte520, AM

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶，強(qiáng)烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

鈣離子檢測(cè)在生命科學(xué)研究中具有關(guān)鍵作用?；跓晒馓结樑c鈣離子結(jié)合的光譜響應(yīng)特性，研究人員可通過(guò)熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光光譜和熒光酶標(biāo)儀等技術(shù)精確監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)變化。自1989年Fluo-3問(wèn)世以來(lái)，后續(xù)開(kāi)發(fā)的Fluo-4、Fluo-8和Cal-520系列探針雖提升了信背比，但Fluo-4仍存在顯著缺陷：與Fluo-3類似，幾乎所有基于Fluo-4的胞內(nèi)鈣檢測(cè)都必須使用丙磺舒（probenecid）來(lái)防止探針外泄，而該抑制劑已被證實(shí)會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的細(xì)胞效應(yīng)，嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果。

Calbryte? 520通過(guò)革命性突破解決了這一技術(shù)難題——其顯著提升的信噪比和優(yōu)化的胞內(nèi)滯留特性（無(wú)需丙磺舒），使其成為目前最可靠的鈣檢測(cè)工具。該探針與Fluo-4具有完全一致的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)，可直接兼容現(xiàn)有Fluo-4檢測(cè)系統(tǒng)的所有參數(shù)設(shè)置，為研究人員提供了更精準(zhǔn)、更便捷的實(shí)驗(yàn)方案。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)：

1.低背景熒光：與Ca2?結(jié)合后顯著增強(qiáng)熒光信號(hào)，能有效降低背景干擾，提高檢測(cè)靈敏度。

2.多色兼容性：綠色熒光，適用于多通道成像

3.細(xì)胞膜通透性： 疏水性AM酯可被動(dòng)穿透細(xì)胞膜，被胞內(nèi)酯酶水解后形成帶負(fù)電荷的熒光染料，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單負(fù)載

產(chǎn)品特性：

1）分子量：1090.90

2）溶劑：DMSO

3）解離常數(shù)（Kd，nM）：1200

4）Ex/Em：493/515

保存條件: 

-20℃避光保存

產(chǎn)品使用：

一、儲(chǔ)備溶液的配制

除非另有說(shuō)明，所有未使用的儲(chǔ)備液應(yīng)在配制后分裝為單次使用量，并保存于-20°C。避免反復(fù)凍融。

Calbryte520, AM 儲(chǔ)備溶液

使用高質(zhì)量無(wú)水DMSO配制2-5 mM的Calbryte520, AM儲(chǔ)備液。請(qǐng)注意，體積僅用于制備儲(chǔ)備溶液。有關(guān)適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)/生理緩沖液，請(qǐng)參閱樣品實(shí)驗(yàn)方案。

注意：Calbryte520, AM溶于DMSO后為無(wú)色透明溶液。

二、工作溶液配制 

Calbryte520, AM 工作溶液

實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將Calbryte520, AM溶解于DMSO或?qū)?chǔ)備液 aliquot 解凍至室溫。

在所選緩沖液（如Hanks和Hepes緩沖液）中加入0.04% Pluronic F-127，配制2-20 μM的Calbryte520, AM工作液。對(duì)于多數(shù)細(xì)胞系，推薦終濃度為4-5 μM。具體染料加載濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化。

注意1： 非離子型表面活性劑Pluronic F-127可增強(qiáng)Calbryte520, AM的水溶性。

注意2： 若細(xì)胞存在有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，可在工作液中加入1-2 mM丙磺舒（貨號(hào)：NBS2007）（孔板終濃度0.5-1 mM）以減少水解后染料的泄漏。我司提供多種丙磺舒：包括水溶性的丙磺舒（NBS2008-154MG），能降低有機(jī)溶劑的使用。

三、實(shí)驗(yàn)操作流程

以下為活細(xì)胞加載AM酯的推薦方案，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際需求調(diào)整。

1. 將細(xì)胞于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中孵育過(guò)夜。

2. 次日向細(xì)胞板中加入1X Calbryte520, AM工作液。

注意：若待測(cè)化合物與血清存在干擾，加載前需更換為新鮮HHBS緩沖液。

3. 將加載染料的細(xì)胞板置于37°C培養(yǎng)箱孵育1-2小時(shí)。

4. 移除工作液，更換為HHBS或含陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（如1 mM丙磺舒）的緩沖液以清除多余探針。

5. 加入刺激劑后，立即使用配備FITC濾光片的熒光顯微鏡或者具備程序化液體處理系統(tǒng)的熒光酶標(biāo)儀（如FDSS、FLIPR或FlexStation）Ex/Em = 490/525 nm，截止波長(zhǎng)515 nm檢測(cè)熒光信號(hào)

注意事項(xiàng)：

1.      熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。。

2.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。