Fluo-5N AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶，強(qiáng)烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細(xì)胞培養(yǎng)級（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內(nèi)加載性。 

產(chǎn)品簡介：

Fluo-5N是Fluo-4的結(jié)構(gòu)類似物，具更低的鈣結(jié)合親和力，使其非常適用于鈣水平在1μM~1mM區(qū)間內(nèi)的胞內(nèi)鈣離子檢測，而Fluo-3和Fluo-4在這個區(qū)間內(nèi)的鈣離子反應(yīng)達(dá)到飽和。Fluo-5N與氬離子激光器的488nm激發(fā)光兼容，使其適用于共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀等儀器。激發(fā)和發(fā)射波長分別是494和516nm。一旦與鈣離子結(jié)合，熒光強(qiáng)度增加大于100倍，波長遷移非常少。

Fluo-5NAM是Fluo-5N的一種乙酰甲酯衍生物，具有細(xì)胞膜滲透性，只需簡單培養(yǎng)，即可輕易進(jìn)入細(xì)胞。

產(chǎn)品特性

1）同義名：Fluo-5N, Acetoxymethyl Ester;

2）分子式：C50H47F2N3O25

3）分子量：1127.92

4）Ex/Em：494/516nm（Ca2+-bound）

5）解離常數(shù)：~90μM

6）純度：≥95% (HPLC)

7）溶解性：溶于DMSO（5mM）

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。

產(chǎn)品使用：

A，試劑準(zhǔn)備

1）配制Pluronic F-127母液：稱取100mg Pluronic F-127粉末（貨號：NBS2009-1g）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2） HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.2)或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1）用無水DMSO溶解Fluo-5NAM配制成2-5mM的儲存液，或?qū)⒁雅浜玫?span>Fluo-5NAM儲存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Fluo-5NAM中加入11μl無水DMSO）。準(zhǔn)備Fluo-5NAM工作液之前，有時需要往Fluo-5NAM儲存液中加入適量的20% Pluronic F-127溶液，以增強(qiáng)AM探針的水溶性。

【注①】：Fluo-5N AM染色工作液制備前，添加一定體積的20% Pluronic F-127溶液到Fluo-5NAM+ DMSO儲存液，從而使Pluronic F-127的最終工作濃度約為0.02%。

2）用HHBS或其他生理緩沖液（含鈣鎂）將Fluo-5NAM+DMSO儲存液稀釋到1-20μM的工作液。

【注①】：Fluo-5N AM應(yīng)用在大部分細(xì)胞的推薦加載濃度為4-5μM，具體的使用濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用最低探針濃度。

3）【可選】如果細(xì)胞內(nèi)（比如CHO細(xì)胞）含有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，以降低去酯化探針的泄露水平。

4）將準(zhǔn)備好的Fluo-5NAM染色工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。室溫或37℃孵育20-120min。

【注①】：若使用含血清的培養(yǎng)基，血清內(nèi)酯酶會降解AM，從而降低Fluo-5NAM加載效果。而含酚紅培養(yǎng)基會使本底值略偏高，建議加入染色工作液前，對細(xì)胞清洗2~3次。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑如1mM丙磺舒的緩沖液）清洗細(xì)胞1~2次，以去除殘留探針。

6）室溫再孵育30min以保證細(xì)胞內(nèi)AM的完全去酯化。

7）用合適的激發(fā)/發(fā)射波長來檢測熒光。

注意事項(xiàng)：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請?jiān)诟稍锏沫h(huán)境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Fluo-5NAM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

4.      Fluo-5NAM第一次使用，建議儲存液現(xiàn)配現(xiàn)用，分裝成單次用量，嚴(yán)格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實(shí)驗(yàn)效果，盡量在短時間內(nèi)使用。

5.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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