Fluo-3, AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針，超級(jí)純（95%）

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶，強(qiáng)烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內(nèi)加載性。 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Fluo-3是一種常用的可見(jiàn)光激發(fā)波長(zhǎng)Ca²⁺熒光探針，具有較高的Ca²⁺捕獲能力，通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化直接反映Ca²⁺信號(hào)的動(dòng)力學(xué)變化。當(dāng)Fluo-3以游離配體形式存在時(shí)幾乎是非熒光性的，但一旦與Ca²⁺結(jié)合即可產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，熒光信號(hào)增強(qiáng)60~80倍，此時(shí)的最大激發(fā)波長(zhǎng)為506nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為526nm?？赏ㄟ^(guò)激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀等來(lái)檢測(cè)胞內(nèi)鈣離子水平的變化。

Fluo-3, AM是Fluo-3的一種乙酰甲酯衍生物，具有細(xì)胞膜滲透性，只需簡(jiǎn)單培養(yǎng)，即可輕易進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Fluo-3，從而滯留在胞內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)生理功能。本品以凍干粉的形式提供，使用時(shí)只需經(jīng)無(wú)水DMSO充分溶解，配置成2~5mM的儲(chǔ)存液，并依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)資料調(diào)整到需要的工作濃度即可。

產(chǎn)品特性：

1）CAS NO：121714-22-5

2）同義名：Fluo-3, Acetoxymethyl Ester

3）分子式：C51H50Cl2N2O23

4）分子量：1129.85

5）純度：≥95% (HPLC)

6）解離常數(shù)（Kd）：390nM (Ca²⁺)

7）最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：506/526 nm

8）溶解性：溶于DMSO（2-5mM）

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。

產(chǎn)品使用： （針對(duì)人T細(xì)胞Ca²⁺濃度檢測(cè)）

A，  試劑準(zhǔn)備

1）配制Pluronic F-127母液

100mg Pluronic F-127粉末（貨號(hào)：NBS2009）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過(guò)程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2）Hanks Balanced Salt Solution（HBSS），w/o Ca²⁺，Mg²⁺

3）HEPES Buffer Saline

配方：10mM HEPES，1mM Na₂HPO₄，137mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl₂，0.5mM MgCl₂，5mM glucose，0.1% BSA，pH 7.4

B，  操作步驟

1）用無(wú)水DMSO溶解Fluo-3, AM配制成2-5mM的儲(chǔ)存液，或?qū)⒁雅浜玫?span>Fluo-3, AM儲(chǔ)存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Fluo-3,AM中加入11μl無(wú)水DMSO）。

2） 向Fluo-3, AM+DMSO溶液中加入等體積的20% Pluronic F-127溶液，Pluronic F-127可以防止Fluo-3, AM在HBSS中聚合并促使探針更好進(jìn)入細(xì)胞。【注】：Pluronic F-127可降低Fluo-3, AM的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時(shí)加入，不建議將其加入儲(chǔ)存液長(zhǎng)期保存。

3）用HBSS稀釋Fluo-3, AM溶液，制備2-5μM的Fluo-3, AM工作液?！咀ⅰ浚和扑]該探針加載濃度在4-5μM，具體的使用濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過(guò)度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用最低濃度探針。

4）  將Fluo-3, AM工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。37℃孵育20min。

5）  加入5倍體積的含有1% FBS的HBSS，繼續(xù)孵育40min。

6）  用HEPES Buffer Saline洗滌細(xì)胞3次，然后用HEPES Buffer Saline使細(xì)胞重懸，制成1×10⁵cells/ml的溶液。

7）  37℃孵育10min，之后用流式細(xì)胞儀或者共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光鈣離子檢測(cè)。最大激發(fā)波長(zhǎng)506nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)526nm。

注意事項(xiàng)：

1.      熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請(qǐng)?jiān)诟稍锏沫h(huán)境放至室溫后再開(kāi)封。由于試劑微量，開(kāi)封前請(qǐng)將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Fluo-3, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

4.      基于BAPTA結(jié)構(gòu)的鈣離子指示劑比如Fluo-3，Fluo-4，能夠結(jié)合很多重金屬陽(yáng)離子（比如：Mn²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺）且實(shí)質(zhì)上親和力高于Ca²⁺。因此，由于這些重金屬離子存在對(duì)鈣測(cè)定的干擾可使用重金屬螯合劑-TPEN（貨號(hào)：NBS5877）來(lái)控制。

5.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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