JC-1 (5mg/ml in DMSO) 線粒體膜電位熒光探針

產(chǎn)品簡介：

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電△Ψm位的理想熒光探針。JC-1染料以電勢依賴性的方式積聚在線粒體內(nèi)，可以用來檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。正常線粒體內(nèi)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，JC-1只能以單體的形式存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光（Ex=514 nm, Em=529 nm）。

JC-1不僅可用于定性檢測，因顏色的變化可以非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。也可以用于定量檢測，因線粒體的去極化程度可以通過紅/綠熒光強(qiáng)度的比例來衡量。觀察時(shí)，只需使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。

本品為溶于DMSO的JC-1儲存液，濃度5 mg/ml，CAS NO.3520-43-2 ，只需用合適的緩沖液稀釋到工作濃度即可使用。JC-1用于檢測細(xì)胞的線粒體膜電位時(shí)常用的濃度范圍為1～20 μg/ml，對于很多細(xì)胞適宜采用的工作濃度為10 μg/ml。   

產(chǎn)品特性：

1）化學(xué)名：5,5‘,6,6’-Tetrachloro-1,1‘,3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide

2）CAS NO：3520-43-2 

3）分子式：C25H27Cl4IN4

4）分子量：652.23 g/mol

5） 純度：＞95%（HPLC）

6） Ex/Em：單體形式（monomer form）：Ex=514 nm, Em=529 nm；

          聚合物形式（J-aggregate form）：Ex=585 nm, Em=590 nm；

保存條件: 

-20℃干燥避光保存。第一次使用建議將儲存液分裝，避免反復(fù)凍融，一年有效。

產(chǎn)品使用：

1. 染色工作液制備

將凍存的儲存液置于室溫充分融化，之后用緩沖液或者預(yù)熱的培養(yǎng)基直接稀釋儲存液（5 mg/ml）到需要的工作濃度，邊震蕩邊稀釋，充分混勻。為了去除任何不溶顆粒，建議13,000 x g離心JC-1工作液1 min，小心吸取上清轉(zhuǎn)移到新的管子內(nèi)。整個(gè)過程要避光操作。【注意】：因JC-1不溶于水，很可能在稀釋到工作液的過程中形成聚集顆粒，建議細(xì)胞染色前用離心或者過濾的方法去除這些顆粒后再使用。

2. JC-1染色步驟（流式細(xì)胞儀）

1）于6-，12或24-孔板上進(jìn)行細(xì)胞鋪板，調(diào)整密度為5×105cells/ml。37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。選擇合適的化合物根據(jù)特定的步驟進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)?！咀⒁狻浚?/strong>進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)時(shí)的細(xì)胞密度建議不超過1×10⁶cells/ml，也可根據(jù)自己的細(xì)胞類型培養(yǎng)至合適的密度。

2）取0.5 ml細(xì)胞懸液至無菌的離心管內(nèi)；

3）室溫條件400 x g離心5 min；吸掉上清。

4）用0.5 ml JC-1工作液重懸細(xì)胞，于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱孵育15-30 min；

【注意】：一般情況，15 min足以進(jìn)行充分的染色。

5）室溫條件400 x g離心5 min；吸掉上清；

6）用2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液或者緩沖液重懸細(xì)胞，之后室溫條件400 x g離心5 min；吸掉上清；

7）重復(fù)步驟6）；

8）用0.5 ml新鮮培養(yǎng)液或者緩沖液重懸細(xì)胞，即可進(jìn)行后續(xù)的流式分析?！咀⒁狻浚赫堮R上進(jìn)行流式定量分析，此細(xì)節(jié)很重要。

數(shù)據(jù)分析：含有紅色JC-1聚集物的健康細(xì)胞線粒體用FL2通道檢測；含有綠色JC-1單體的凋亡或不健康細(xì)胞用FL1（FITC）通道檢測。

3. JC-1染色步驟（熒光顯微鏡）

A. 懸浮細(xì)胞

1）-6）同上JC-1染色步驟（流式細(xì)胞儀）；

7）用0.3 ml緩沖液重懸細(xì)胞，即可進(jìn)行熒光顯微鏡檢測?！咀⒁狻浚赫堮R上進(jìn)行熒光顯微分析，此細(xì)節(jié)重要。

數(shù)據(jù)分析：使用可同時(shí)檢測FITC/TRITC或者FITC/Texas RedTM的雙帶帶通濾波器進(jìn)行檢測。健康細(xì)胞因JC-1聚集后線粒體呈紅色，最大發(fā)射波長為590 nm。而凋亡/壞死細(xì)胞內(nèi)的JC-1以單體形式存在，線粒體呈綠色，最大發(fā)射波長為530 nm。

B.  貼壁細(xì)胞

1）培養(yǎng)皿內(nèi)用蓋玻片進(jìn)行細(xì)胞爬片或者細(xì)胞培養(yǎng)在腔室玻片（chamber slide）上。選擇合適的化合物根據(jù)特定的步驟進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)。

2）染色前開始配制JC-1工作液，配制步驟見上。

3）吸掉細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入足夠覆蓋所有細(xì)胞的JC-1工作液。于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱孵育15-30 min；【注意】：一般情況，15 min足以進(jìn)行充分的染色。

4）吸掉培養(yǎng)液，然后用合適的緩沖液清洗細(xì)胞2次。

5）加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液（培養(yǎng)液可含血清和酚紅）或者PBS緩沖液，于熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察。數(shù)據(jù)分析同A.懸浮細(xì)胞。

4. JC-1染色步驟（熒光酶標(biāo)儀）

1）-7）同上JC-1染色步驟（流式細(xì)胞儀）；

8）用0.3 ml緩沖液重懸細(xì)胞；然后按照每孔0.1 ml的量將染色好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到黑色的96孔板內(nèi)，即可進(jìn)行熒光酶標(biāo)板分析?！咀⒁狻浚赫堮R上進(jìn)行熒光顯微分析，此細(xì)節(jié)重要。

數(shù)據(jù)分析：健康細(xì)胞，JC-1單體聚集形成聚合物，線粒體呈現(xiàn)強(qiáng)烈的紅色熒光（激發(fā)波長550 nm，發(fā)射波長600 nm）。而凋亡或壞死細(xì)胞內(nèi)JC-1以單體形式存在，線粒體呈強(qiáng)烈的綠色熒光（激發(fā)波長485 nm,發(fā)射波長535nm）。之后計(jì)算紅色熒光信號與綠色熒光信號的比值，用來判斷細(xì)胞健康程度。

注意事項(xiàng)：

1.      JC-1是光敏感性的，所有染色步驟的操作過程中避免強(qiáng)光接觸。

2.      JC-1染色完成后，立即進(jìn)行后續(xù)的結(jié)果分析非常必要。

3.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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