Hoechst 33342/PI Double Stain Kit 凋亡/壞死雙染試劑盒

溫馨提示：見我司整理的細(xì)胞核（Cell Nuclear）熒光探針產(chǎn)品專題。

產(chǎn)品描述

Hoechst 33342/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒（Hoechst 33342/PI Double Stain Kit）是一種采用Hoechst 33342和碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）雙染進(jìn)行細(xì)胞凋亡與壞死分析的檢測試劑盒。檢測原理在于：Hoechst 33342是一種活細(xì)胞核染料，能穿透正常細(xì)胞以及凋亡細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合（最大激發(fā)波長為350nm，發(fā)射波長為461nm），呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，染色質(zhì)發(fā)生固縮，染色后的細(xì)胞熒光比正常細(xì)胞明顯增強(qiáng)。而PI是一種死細(xì)胞核染料，不能穿透細(xì)胞膜，對于具完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞不能染色。但對于壞死細(xì)胞，由于膜的完整性喪失，PI能夠穿透進(jìn)入細(xì)胞，與DNA結(jié)合（最大激發(fā)波長為536nm，發(fā)射波長為617nm），呈現(xiàn)紅色熒光。經(jīng)Hoechst 33342/PI雙染后，使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測，正常細(xì)胞為弱紅色熒光+弱藍(lán)色熒光；凋亡細(xì)胞為弱紅色熒光+強(qiáng)藍(lán)色熒光；壞死細(xì)胞為強(qiáng)紅色熒光+弱藍(lán)色熒光。

本試劑盒可檢測100個(gè)樣品，每個(gè)樣本的細(xì)胞數(shù)量可為10⁵-10⁶個(gè)。

產(chǎn)品包裝

保存與運(yùn)輸方法

保存：-20℃保存，1年有效。使用頻繁可置4℃保存，5個(gè)月有效。Hoechst染色液和PI染色液需避光保存。

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1）熒光染料均存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。

2）Hoechst 33342孵育細(xì)胞時(shí)間不宜過長，一般控制在20min內(nèi)。太長容易引起探針的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光遷移，導(dǎo)致紅色熒光與藍(lán)色熒光的比例改變。

3）PI對人體有一定的刺激性，請注意適當(dāng)防護(hù)。

4）如果要進(jìn)行組織的凋亡和壞死檢測，請將組織消化制備成單細(xì)胞懸液后再檢測。

5）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法：

一、細(xì)胞樣本制備

1.1貼壁細(xì)胞

1.1.1 小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一個(gè)無菌離心管內(nèi)備用；

1.1.2 用胰蛋白酶消化細(xì)胞至細(xì)胞可以輕輕用移液槍或槍頭吹打下來，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞

1.1.3 收集上述細(xì)胞懸液到離心管內(nèi)，4℃，1000g離心3~5min，使細(xì)胞沉至管底，小心吸取上清并丟棄，可留約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細(xì)胞?！咀⒁狻浚耗承┨厥饧?xì)胞，如果沉淀不充分，可以適當(dāng)提高離心力或者延長離心時(shí)間。

1.1.4 加入約1ml提前預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到1.5ml無菌離心管，4℃，1000g離心3~5min，使細(xì)胞沉至管底。

1.1.5 小心吸取上清并丟棄，可留約50μl PBS，以免吸走細(xì)胞。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

1.2 懸浮細(xì)胞

1.2.1 4℃，1000g離心3~5min，使細(xì)胞沉至管底，小心吸取上清并丟棄，可留約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細(xì)胞。

1.2.2 加入約1ml提前預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到1.5ml無菌離心管，4℃，1000g離心3~5min，使細(xì)胞沉至管底。

1.2.3 小心吸取上清并丟棄，可留約50μl PBS，以免吸走細(xì)胞。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

二、染色前制備

2.1細(xì)胞染色緩沖液（1×）的準(zhǔn)備：取適量細(xì)胞染色緩沖液（2×）與無菌去離子水或蒸餾水等比例混合，即為細(xì)胞染色緩沖液（1×），4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

2.2 細(xì)胞重懸：將上述收集好的0.1~1×06細(xì)胞，加入0.9ml細(xì)胞染色緩沖液（1×），重懸細(xì)胞沉淀。

三、Hoechst 33342/PI雙染

3.1加入5μl Hoechst 33342染色液，置于37℃水浴，孵育5~15min。

3.2置于冰水冷卻，4℃，1000g離心3~5min，使細(xì)胞沉至管底，棄上層染色液。

3.3加入0.9ml細(xì)胞染色緩沖液（1×），重懸細(xì)胞沉淀。

3.4加入5μl PI染色液，置于冰浴或4℃，孵育20~30min。

【注意】：也可一步法進(jìn)行染色：加入5μl Hoechst 33342染色液和5μl PI染色液，輕輕混勻，置于冰浴或4℃，孵育20~30min。

四、結(jié)果分析

4.1流式細(xì)胞儀檢測

用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長400~500nm處檢測藍(lán)色熒光，在＞630nm處檢測紅色熒光，同時(shí)檢測光散射情況。采用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。

4.2熒光顯微鏡檢測

檢測前，4℃，1000g離心3～5min沉淀細(xì)胞，用PBS洗滌一次，再涂片觀察紅色和藍(lán)色熒光。

【注意】：對于貼壁細(xì)胞，也可不收集細(xì)胞，棄培養(yǎng)液后直接依次按照上述比例加入細(xì)胞染色緩沖液（1×）、Hoechst 33342染色液、PI染色液，置于冰浴或4℃，孵育20～30min。染色后，PBS洗滌一次，再在熒光顯微鏡下觀察。

4.3 結(jié)果呈現(xiàn)

正常細(xì)胞呈低藍(lán)光/低紅光，凋亡細(xì)胞呈高藍(lán)光/低紅光；壞死細(xì)胞呈低藍(lán)光/高紅光。

注意事項(xiàng)：

1）Hoechst 33342、PI對人體有害，請注意適當(dāng)防護(hù)；

2）Hoechst 33342、PI需避光，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程盡量避光操作；

3）熒光染料均存在淬滅情況，建議染色后需盡快檢測；

4）Hoechst 33342 與細(xì)胞孵育時(shí)間不宜過長，一般控制在20 min以內(nèi)。太長容易引起該染料的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光遷移，導(dǎo)致紅色熒光和藍(lán)色熒光比例改變。

5）如果用于組織樣品檢測，則必須把組織消化制備成單細(xì)胞懸浮液后才可以進(jìn)行檢測。

6）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。