活體成像研究底物之：Coelenterazine 腔腸素
活體成像研究底物之：
Coelenterazine 腔腸素（Rluc/Gluc報告基因）
— —活體成像研究/體外生物發(fā)光研究
基本描述：
腔腸素（Coelenterazine）是在水生生物中發(fā)現(xiàn)的一種發(fā)光基團（luminophore），是許多熒光素酶的作用底物，包括海腎熒光素酶（Renilla reniformis luciferase, Rluc），分泌型膜錨定熒光素酶（Gaussia luciferase, Gluc）和藪枝蟲熒光素酶（Obelia luciferase），和發(fā)光蛋白包括水母發(fā)光蛋白（Aequorin）的構(gòu)成之一。前者的作用原理是以腔腸素為底物的熒光素酶，在含分子氧的條件下，氧化腔腸素產(chǎn)生高能量的中間產(chǎn)物，在此過程發(fā)射藍色光，光波長在450~480nm。不同于甲蟲（或螢火蟲）熒光素/熒光素酶（FLuc）系統(tǒng)不同，在含分子氧的條件下，還需要ATP和Mg2+的存在才能同時發(fā)光，光波長在550-570nm。由于生物發(fā)光信號和底物的差異，RLuc常常與FLuc聯(lián)合用于多報告基因研究。后者的作用原理是由脫輔基水母發(fā)光蛋白(Apoaequorin, APO)，分子氧和腔腸素組成的復(fù)合物形成活化的水母發(fā)光蛋白（Aequorin），一旦與鈣離子結(jié)合后，復(fù)合物結(jié)構(gòu)被破壞，腔腸素被氧化生成高能產(chǎn)物（Coelenteramide），同時釋放出CO2和藍色光。
腔腸素應(yīng)用甚是廣泛，包括：1）活細胞或組織的鈣離子檢測；2）細胞或組織的超氧化物和過氧亞硝基陰離子（活性氧，ROS）化學(xué)發(fā)光檢測；3）基因報告基因檢測；4）動物活體檢測；5）ELISA和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）用于蛋白相互作用研究；6）藥物高通量篩選（HTS）。
腔腸素的幾個重要應(yīng)用：
A、腔腸素/水母蛋白復(fù)合物用于鈣離子檢測（Coelenterazine/aequorin complex for calcium measurement）
A1、與傳統(tǒng)熒光法鈣離子濃度檢測的優(yōu)勢
傳統(tǒng)熒光法鈣離子檢測工具琳瑯滿目，由紫外光激發(fā)到可見光激發(fā)的鈣離子檢測，比如，Fura-2激發(fā)光比率型熒光探針，Fluo-8最亮的鈣離子熒光探針，鈣離子檢測的靈敏度越來越高，也越來越方便，對儀器的要求也越來越低，那么腔腸素/水母蛋白系統(tǒng)對鈣離子檢測的優(yōu)勢在哪呢？
● 鈣離子/水母蛋白復(fù)合物（Ca2+/aequorin complex）能檢測寬廣范圍的鈣離子濃度，從~0.1μM到＞100μM。
● 比熒光法探針的背景低，樣本本身不會發(fā)生自熒光。
● 雖然信號比熒光法低，但用成像儀能得到更高的信噪比。
● 水母蛋白復(fù)合物（aequorin complex）不會從細胞內(nèi)泄露出來，因此能監(jiān)測幾小時至數(shù)天內(nèi)細胞鈣離子（Ca2+）濃度變化。
A2、工作原理
由脫輔基水母發(fā)光蛋白(Apoaequorin, APO)，分子氧和腔腸素組成的復(fù)合物形成活化的水母發(fā)光蛋白（Aequorin），一旦與鈣離子結(jié)合后，復(fù)合物結(jié)構(gòu)被破壞，腔腸素被氧化生成高能產(chǎn)物（Coelenteramide），同時釋放出CO2和藍色光（~466nm）。
圖1. 腔腸素/水母蛋白復(fù)合物用于鈣離子檢測的反應(yīng)流程。
B、生物共振能量轉(zhuǎn)移（BRET for assaying protein-protein interactions）
B1、工作原理
BRET是一種高級的、無破壞性和以細胞為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)，極其適合蛋白組學(xué)研究，包括受體研究和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的路線圖。該技術(shù)是基于含生物發(fā)光熒光素酶和GFP變體融合蛋白之間的非放射性能量轉(zhuǎn)移。
大部分應(yīng)用中融合供體是海腎熒光素酶（RLuc），而不是水母發(fā)光蛋白（Aequorin），目的是為了避免對水母來源GFP突變蛋白的內(nèi)源性親和性。受體是黃色熒光蛋白（YFP），能夠提高良種發(fā)射光間的光譜區(qū)分。當(dāng)供體和受體靠近，對腔腸素衍生物底物催化降解后產(chǎn)生的能量從熒光素酶轉(zhuǎn)移到YFP，從而使其釋放自身的熒光。BRET比值的計算顯示體內(nèi)是否存在蛋白-蛋白相互作用，這種檢測方法有效去除光輸出波動可能造成數(shù)據(jù)的變動，比如由于反應(yīng)體積、細胞類型、每孔細胞數(shù)目和/孔間信號延誤等引起光輸出波動。
B2、BRET與FRET相比的優(yōu)勢
熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），生物發(fā)光供體被第二種熒光素所替代，其發(fā)射光譜與受體熒光素的激發(fā)光譜重疊。與FRET相比，BRET的主要優(yōu)勢在于：沒有光淬滅或供體蛋白的光異構(gòu)化，對細胞無光損傷，無光散射，或細胞或酶標(biāo)板的自發(fā)熒光。因沒有受體直接激發(fā)引起的光發(fā)射，BRET背景更低，允許檢測更低濃度蛋白間的相互作用。
C、報告基因檢測（Rluc as a reporter gene）
海腎熒光素酶（Rluc）用作報告基因以研究體內(nèi)外的基因調(diào)控和功能，普遍用于多重轉(zhuǎn)錄報告基因檢測或用作熒光蟲熒光素酶轉(zhuǎn)染的內(nèi)參。
工作原理如下：海腎熒光素酶（RLuc），分子量為36kDa的單體蛋白，在氧氣的作用下氧化腔腸素生成熒光（見圖2）。Rluc不需要通過后期的翻譯加工來獲得活性，只需要翻譯后就能用作基因報告子。
圖2. 海腎熒光素酶（Rluc）催腔腸素發(fā)光的反應(yīng)流程。
我司提供天然腔腸素以及幾種腔腸素衍生物，它們對鈣離子的親和力，光譜特性，以及應(yīng)用傾向上會有差異，詳見表1—天然腔腸素及其衍生物的光譜特性，表2—天然腔腸素及其衍生物的應(yīng)用差異選擇適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品。
表1 天然腔腸素及其衍生物的光譜特性：
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | Em (nm) | RLC[1] | Relative Intensity[2] | Half-rise time (ms) [3] |
466 | 1.00 | 1 | 6-30 | ||
466 | 0.75 | 16 | 6-30 | ||
400 | / | / | / | ||
405&465 | 0.5 | 4 | 0.15-0.3 | ||
472 | 0.80 | 20 | 6-30 | ||
442 | 0.63 | 28 | 2-5 | ||
445 | 0.65 | 500 | 2-5 | ||
468 | 0.25 | 0.15 | 6-30 | ||
[1] RLC = relative luminescence capacity: Total time-integrated emission of aequorin in saturating Ca2+relative to native aequorin = 1.0. [2] Ratio of the luminescence of aequorin reconstituted with coelenterazine analog relative to native aequorin at 100 nM Ca2+. [3] Half-Rise Time: The half-rise time is the time for the luminescence signal to reach 50% of the maximum after addition of 1 mM Ca2+to a standard of aequorin reconstituted with the coelenterazine analog of interest. All data are from O. Shimomura in Cell Calcium 14, 373 (1993). | |||||
表2天然腔腸素及其衍生物的應(yīng)用差異：
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 應(yīng)用特征 |
應(yīng)用非常廣泛的標(biāo)準(zhǔn)底物。腔腸素是天然水母發(fā)光蛋白復(fù)合物的發(fā)光基團，也是海腎熒光素酶（Rluc）的底物。底物的快速再生（fast regeneration）比較重要的實驗推薦使用天然腔腸素。 1）生物發(fā)光檢測鈣離子的靈敏度非常高，檢測范圍從0.1μM到＞100μM；2）使用腔腸素監(jiān)測報告基因表達是其主要應(yīng)用；3）其他應(yīng)用包括生物共振能量轉(zhuǎn)移BRET，化學(xué)發(fā)光檢測細胞或組織內(nèi)的超氧陰離子和過氧化亞硝基陰離子水平（ROS）； | ||
1）腔腸素h形成的水母發(fā)光蛋白復(fù)合物比天然腔腸素復(fù)合物的光強度高10倍以上；2）比天然腔腸素對鈣離子敏感度更高；3）也適用報告基因分析。 | ||
也稱為DeepBlue C，是一種腔腸素衍生物，用作海腎熒光素酶Rluc的底物，發(fā)射峰約400nm。含GFP受體的BRET研究是Rluc的首選底物，因其對GFP受體的發(fā)射波干擾非常小。不可用作Gluc底物。 | ||
體外水母發(fā)光蛋白再生中腔腸素e的速度最高，具有雙發(fā)射峰，分別為405nm和465nm，使其能在pCa 5-7范圍內(nèi)通過雙發(fā)射峰熒光強度比率的方式測定Ca2+濃度，提高檢測準(zhǔn)確度。但由于滲透性差，不適合胞內(nèi)應(yīng)用。在溶液中穩(wěn)定性差。 | ||
腔腸素f形成的水母發(fā)光蛋白復(fù)合物的光強度是天然腔腸素復(fù)合物的20倍，最大發(fā)射波長約長8nm。具有最好的細胞滲透性。當(dāng)需要具極高鈣離子Ca2+靈敏度的水母發(fā)光蛋白復(fù)合物，建議用腔腸素f。 | ||
Coelenterazine cp產(chǎn)生水母發(fā)光蛋白復(fù)合物的光強度是天然腔腸素復(fù)合物的15倍，且具有更快的Ca2+反應(yīng)性。 | ||
其生物發(fā)光強度最高（腔腸素hcp形成水母發(fā)光蛋白復(fù)合物的熒光強度比天然腔腸素復(fù)合物高190倍），對Ca2+反應(yīng)速度快。 | ||
腔腸素fcp形成的水母發(fā)光蛋白復(fù)合物的光強度是天然腔腸素復(fù)合物的135倍。 | ||
所有的腔腸素衍生物中熒光強度最弱，對Ca2+反應(yīng)時間明顯慢于天然腔腸素。一種非常有用的低靈敏腔腸素。 | ||
體外腔腸素i水母發(fā)光蛋白復(fù)合物的熒光強度僅為天然腔腸素復(fù)合物的3%，在所有腔腸素衍生物種對鈣離子的反應(yīng)時間最慢。 | ||
體外腔腸素ip水母發(fā)光蛋白復(fù)合物的熒光強度幾乎比天然腔腸素復(fù)合物高50倍，但對鈣離子的反應(yīng)時間比天然腔腸素慢。 | ||
非常優(yōu)越的抗氧化劑，靶向細胞內(nèi)來源于單態(tài)氧和超氧化物陰離子產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)（ROS）。 |
腔腸素系列產(chǎn)品重要事項：
1. 腔腸素凍干粉需-20℃避光保存，且保存在惰性氣體下。
2. 溶于甲醇或乙醇，不可溶于DMSO。
3. 腔腸素儲存液不建議保存在-20℃或-70℃。因腔腸素是一種高能量的雙雜環(huán)丁酮環(huán)狀結(jié)構(gòu)，即使在低溫下也會自發(fā)降解。
綜合以上的特征，我司提供所有凍干粉產(chǎn)品都含惰性氣體保證其穩(wěn)定性。且多以小包裝（50μg或500μg）的形式提供，以減少因單次使用不完造成的資源浪費。
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝規(guī)格 |
500ug | ||
500ug | ||
500ug | ||
500ug | ||
500ug | ||
50ug | ||
250ug | ||
50ug | ||
50ug | ||
50ug | ||
50ug | ||
500ug | ||
50ug |
體內(nèi)注射用腔腸素產(chǎn)品：
我司特別提供專門用于體內(nèi)動物實驗研究用的注射用腔腸素產(chǎn)品。粉末不僅純度非常高，且提供特別溶劑以增強粉末的溶解能力。
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝規(guī)格 |
2x500ug | ||
20x500ug | ||
2x500ug | ||
20x500ug |
應(yīng)用示例【生物化學(xué)發(fā)光體內(nèi)成像】
Fig. In vivo visualization of mitochondrial Ca2+uptake in the hindlimb muscle after stimulation of the sciatic nerve. (A) Direct visualization of Ca2+-induced bioluminescence in the hindlimb muscle after tetanic stimulation of the sciatic nerve (5 ms pulses at 50 Hz for 2.5 s). Each frame represents 1 s of light accumulation superimposed with the video image taken before the acquisition of bioluminescence. The FOV was 16×12 cm. Smoothing has been applied to the bioluminescent image overlay to a resolution of 1 mm. Color scale is in photons/pixel/s. (B) Mice were injected (i.v) with native coelenterazine (4 mg/kg) and Ca2+-induced light emission was recorded immediately after in the hindlimb muscles in response to tetanic stimulations applied every 2 minutes over more than 1.5 hours. The plot shows the increasing amplitude of the light response (photons/s) as a function of time.【文獻來源：Non-Invasive In Vivo Imaging of Calcium Signaling in Mice. PMC1991622】
注意事項：
1. 所有產(chǎn)品僅供科研用途，不可用做臨床或診斷用途。
2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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