膜電位熒光探針產(chǎn)品專(zhuān)題（Probes forMembrane Potential）

（線粒體膜電位、細(xì)胞質(zhì)膜電位）

? 快速響應(yīng)熒光探針（Fast-response fluorescent probes）

代表性：ANEP染料，RH染料

? 慢速響應(yīng)熒光探針（Slow-response fluorescent probes）

代表性：短鏈碳菁類(lèi)染料，JC-1染料，羅丹明123染料，DiBAC染料

一個(gè)細(xì)胞典型的質(zhì)膜跨膜電位約為70mV（胞內(nèi)為負(fù)電荷）。膜電位的增加和降低，分別稱(chēng)為膜超極化（Membrane hyperpolarization）和去極化（Membrane depolarization），在許多生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括神經(jīng)沖動(dòng)的傳播、肌肉收縮、細(xì)胞信號(hào)和離子通道門(mén)控。電位探針（Potentiometric probes）是用來(lái)研究這些過(guò)程的重要工具，以及用于線粒體觀察（線粒體的跨膜電位約為150mV，內(nèi)部基質(zhì)呈負(fù)電荷），用于評(píng)估細(xì)胞活力，和用于候選新藥的高通量篩選。

電位探針（Potentiometric probes）包括陽(yáng)離子或兩性苯乙烯染料，陽(yáng)離子碳花菁和羅丹明，陰離子氧鎓醇。染料的歸類(lèi)確定因素包括在細(xì)胞的聚集方式、反應(yīng)基制和毒性。根據(jù)這些染料的光學(xué)反應(yīng)、光毒性，與其他分子的相互作用，來(lái)選擇合適的電位探針滿足特定的用途。根據(jù)染料的光學(xué)反應(yīng)可將其分為兩大類(lèi)：

一、快速響應(yīng)探針（Fast-response probes）

1.1 工作原理

快速響應(yīng)探針（通常為苯乙烯吡啶鹽染料）通過(guò)電子結(jié)構(gòu)的變化引起熒光特征變化來(lái)工作，對(duì)周?chē)碾娮訄?chǎng)變化做出反應(yīng)（見(jiàn)圖1）。在興奮細(xì)胞中其光學(xué)反應(yīng)足夠快以檢測(cè)瞬時(shí)電位變化（毫秒ms），包括單一神經(jīng)元、心肌細(xì)胞和完整大腦。然而，它們電位依賴(lài)性的熒光變化數(shù)量級(jí)通常很小。快速響應(yīng)探針通常情況每100mV產(chǎn)生2-10%的熒光變化。

圖1. 膜電位敏感探針的反應(yīng)基制（Response mechanisms of membrane potential–sensitive probes）。快速響應(yīng)探針經(jīng)歷電子場(chǎng)驅(qū)動(dòng)的分子內(nèi)電荷分布變化，從而產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的光譜特征或熒光強(qiáng)度變化（本圖通過(guò)顏色標(biāo)示變化來(lái)闡述）。慢速響應(yīng)探針是親脂性陰離子（本圖）或陽(yáng)離子通過(guò)電泳機(jī)制轉(zhuǎn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。熒光變化與跨膜重新分布相關(guān)（本圖通過(guò)顏色標(biāo)示變化來(lái)闡述），歸因于探針對(duì)胞內(nèi)和胞外環(huán)境的敏感性。因此，電位反應(yīng)速度直接體現(xiàn)基礎(chǔ)過(guò)程所需的時(shí)間常數(shù)——電子的快速分子內(nèi)重新分布&完整分子相對(duì)較慢的跨膜運(yùn)動(dòng)。

1.2 快速響應(yīng)探針?lè)N類(lèi)

◇ ANEP染料

ANEP (AminoNaphthylEthenylPyridinium)染料由Leslie Loew和同事開(kāi)發(fā)，是最靈敏的快速響應(yīng)探針。兩性離子的di-4-ANEPPS（貨號(hào)：NBS3227）和di-8-ANEPPS（貨號(hào)：NBS3228）在各種組織、細(xì)胞和模型膜系統(tǒng)中表現(xiàn)出相當(dāng)一致的熒光變化速率（10%熒光變化/100mV）。ANEP染料毫秒級(jí)的時(shí)間特征彌補(bǔ)其中等響應(yīng)振幅（見(jiàn)圖2）。di-4-ANEPPS（貨號(hào)：NBS3227）非常快速被細(xì)胞內(nèi)在化，阻止其用在除極短期實(shí)驗(yàn)之外的應(yīng)用中，然而，di-8-ANEPPS（貨號(hào)：NBS3228）能更好的保留在質(zhì)膜的外層。另外，雖然兩種染料都具有良好的光穩(wěn)定和低毒性，報(bào)道提及di-8-ANEPPS（貨號(hào)：NBS3228）比di-4-ANEPPS（貨號(hào)：NBS3227）具微好的光穩(wěn)定性和顯著更低的光毒性。

與其他的苯乙烯染料相似，ANEP染料在水溶性溶液內(nèi)基本無(wú)熒光，呈現(xiàn)的光譜特征強(qiáng)烈取決于所處環(huán)境。與磷脂小體結(jié)合后，di-8-ANEPPS（貨號(hào)：NBS3228）最大吸收/發(fā)射波長(zhǎng)約為467/631nm，相對(duì)在甲醇內(nèi)的最大激發(fā)/發(fā)射約為498/713nm。di-4-ANEPPS（貨號(hào)：NBS3227）結(jié)合到神經(jīng)膜的最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)約為475/617nm。

di-8-ANEPPS（貨號(hào)：NBS3228）和di-4-ANEPPS（貨號(hào)：NBS3227）兩者皆對(duì)膜電位（超極化）增加做出響應(yīng)，~440nm激發(fā)處熒光降低，而530nm處激發(fā)熒光增加。這些光譜的遷移允許使用比率法來(lái)關(guān)聯(lián)化膜電位與熒光信號(hào)變化。

圖2. 使用快速響應(yīng)探針di-4-ANEPPS檢測(cè)兔完整心臟的動(dòng)作電位（Detection of action potentials in intact rabbit hearts using the fast potentiometric probe di-4-ANEPPS）。Excised rabbit hearts were loaded with di-4-ANEPPS by perfusion with dye-containing medium. Fluorescence was excited at 488 nm by an argon-ion laser. Emission components at 540 ± 6 nm (green) and >610 nm (red) were detected simultaneously by two photomultipliers (panel A). The ratio of the green to red signals (panel B) displayed a larger fractional change during action potential cycles than either of the component signals; it also followed transmembrane voltage contours recorded simultaneously by an intracellular microelectrode (panel C). In addition, fluorescence ratio measurements reduce the motion artifacts that typically distort optical signals detected from contracting hearts. Figure reproduced with permission from Am J Physiol Heart Circ Physiol (2000) 279:H1421.

◇ RH染料

最先由Rina Hildesheim合成，RH染料包含一系列dialkylaminophenylpolyenylpyridinium染料，主要用于神經(jīng)元的功能成像。大量RH染料類(lèi)似物的存在反映一種現(xiàn)象就是沒(méi)有一種單一染料能提供所有實(shí)驗(yàn)條件需要的光學(xué)反應(yīng)。目前，最廣泛使用的RH染料是RH 237（貨號(hào)：NBS3214）、RH 414（貨號(hào)：NBS3216）、RH 421（貨號(hào)：NBS3215）和RH 795（貨號(hào)：NBS3217）。不同類(lèi)似物染色的生理效應(yīng)并非完全相同。例如，用RH 414（貨號(hào)：NBS3216）染大腦皮層引起動(dòng)脈收縮，用RH 795（貨號(hào)：NBS3217）則不會(huì)。體外對(duì)海馬腦片或體內(nèi)對(duì)貓和猴子視覺(jué)皮質(zhì)（單細(xì)胞記錄）進(jìn)行檢測(cè)，RH795產(chǎn)生可忽略的副反應(yīng)。

與ANEP染料相似，RH染料對(duì)膜電位變化做出反應(yīng)，產(chǎn)生可變程度的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜遷移。它們的吸收和熒光光譜也強(qiáng)烈取決于所處環(huán)境。RH414結(jié)合到磷脂小體上的光譜類(lèi)似于神經(jīng)元質(zhì)膜上的。結(jié)合使用RH染料和熒光鈣離子指示劑允許同時(shí)對(duì)膜電位（RH 237（貨號(hào)：NBS3214））和胞內(nèi)鈣離子（Rhod-2 AM（貨號(hào)：NBS7640））進(jìn)行心肌單細(xì)胞層的成像檢測(cè)。

1.3 快速響應(yīng)探針特征和應(yīng)用匯總

二、慢速響應(yīng)探針（Slow-response probes）

2.1 工作原理

慢速響應(yīng)探針根據(jù)跨膜分布表現(xiàn)出電位依賴(lài)的變化，隨之是熒光的變化（見(jiàn)圖3）。

圖3. 膜電位敏感探針的反應(yīng)基制（Response mechanisms of membrane potential–sensitive probes）。快速響應(yīng)探針經(jīng)歷電子場(chǎng)驅(qū)動(dòng)的分子內(nèi)電荷分布變化，從而產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的光譜特征或熒光強(qiáng)度變化（本圖通過(guò)顏色標(biāo)示變化來(lái)闡述）。慢速響應(yīng)探針是親脂性陰離子（本圖）或陽(yáng)離子通過(guò)電泳機(jī)制轉(zhuǎn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。熒光變化與跨膜重新分布相關(guān)（本圖通過(guò)顏色標(biāo)示變化來(lái)闡述），歸因于探針對(duì)胞內(nèi)和胞外環(huán)境的敏感性。因此，電位反應(yīng)速度直接體現(xiàn)基礎(chǔ)過(guò)程所需的時(shí)間常數(shù)——電子的快速分子內(nèi)重新分布&完整分子相對(duì)較慢的跨膜運(yùn)動(dòng)。

2.2 慢速響應(yīng)探針?lè)N類(lèi)

◇ 碳花菁染料（DiI, DiS and DiO Derivatives）

帶短烷基尾（<7個(gè)碳原子）的DiI，DiS和DiO屬于第一代開(kāi)發(fā)的電位熒光探針。這些陽(yáng)離子染料聚集在超極化的膜上，然后轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入脂質(zhì)雙分子層。聚集進(jìn)入封閉的膜內(nèi)部通常引起降低的熒光，雖然變化幅度和熒光反應(yīng)的方向強(qiáng)烈取決于染料濃度和染料的結(jié)構(gòu)特征。

DiOC6(3) (貨號(hào)：NBS3219) 是最廣泛使用的膜電位測(cè)定用碳花菁染料，緊隨其后的是DiOC5(3) (貨號(hào)：NBS3224) 。流式測(cè)定中，碳花菁熒光強(qiáng)度的測(cè)定不僅取決于膜電位，也受細(xì)胞大小影響。某些情況下，前散射熒光的測(cè)定通常用來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞大小變量引起的光學(xué)變量。熒光比率法采用DiOC2(3) (貨號(hào)：NBS3218) 在發(fā)射光譜內(nèi)的電位依賴(lài)紅光遷移來(lái)測(cè)定細(xì)菌膜電位（見(jiàn)圖4）。碳花菁染料，特別是thiacyanines（比如DiSC3(5)，貨號(hào)：NBS3224），能抑制呼吸，因此可能具有相對(duì)細(xì)胞毒性。

圖4. 金黃色葡萄球菌菌群經(jīng)30μM DiOC2(3)染色的雙色流式分析圖（Two-color flow cytometric analysis of Staphylococcus aureus populations stained with 30 μM DiOC2(3) in the presence (red) or absence (blue) of the metabolic uncoupler CCCP. N ote the variability (~100-fold range) of the green and red fluorescence intensities. B) The same data expressed as red/green fluorescence intensity ratios. Ratio values are calculated by subtracting the logarithmic green fluorescence channel value from the corresponding logarithmic red fluorescence channel value.

◇ JC-1和JC-10

JC-1 (貨號(hào)：NBS3203)在低濃度或低膜電位下呈綠色熒光單體，然而，在更高濃度（水溶性濃度＞0.1uM）或更高電位，形成紅色熒光的J-聚集體（J-aggregates），具寬激發(fā)光譜和非常窄的發(fā)射光譜。由于J-聚集體形成的增加與一定范圍內(nèi)（30-180mV）膜電位的變化呈線性關(guān)系，這一現(xiàn)象則可被電位測(cè)定所采用（見(jiàn)圖5 JC-1工作原理示意圖）。相對(duì)于質(zhì)膜，JC-1更特異性識(shí)別線粒體膜電位。比其他的陽(yáng)離子染料比如DiOC6(3)和羅丹明123，去極化響應(yīng)的持續(xù)性更好。

各種類(lèi)型的比率測(cè)定都可進(jìn)行，通過(guò)組合綠色熒光JC-1單體（Ex/Em~514/529nm）和紅色熒光J-聚集體（Ex/Em~585/590nm），后者能在485nm-最大吸收波長(zhǎng)的范圍內(nèi)被有效激發(fā)。用于檢測(cè)熒光素（FITC）和四甲基羅丹明的光學(xué)濾片能分別用來(lái)檢測(cè)單體和聚集體形式。另外，兩種形式能同時(shí)用熒光素長(zhǎng)通光學(xué)濾片設(shè)置來(lái)檢測(cè)。對(duì)于流式檢測(cè)，JC-1能用488nm激發(fā)，通過(guò)二元模式分別用綠色通道檢測(cè)單體和紅色通道檢測(cè)J-聚集體。

JC-1普遍用于檢測(cè)凋亡細(xì)胞的線粒體去極化（JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒，貨號(hào)：NBS3204）和分析多藥耐藥細(xì)胞。也常用來(lái)評(píng)估基于細(xì)胞高通量測(cè)定的線粒體功能評(píng)估。JC-10是JC-1的升級(jí)版本，熒光特征類(lèi)似于JC-1，探針本身具更好的水溶性。

圖5. JC-1進(jìn)入線粒體和生成J-聚集體的示例流程圖（Schematic illustration depicting JC-1 entry into the mitochondria and the generation of J aggregate）。JC-1，陽(yáng)離子碳菁類(lèi)染料（綠色）以膜電位依賴(lài)形式聚集在線粒體并開(kāi)始形成J-聚集體（紅色）。當(dāng)發(fā)生去極化，仍保持單體形式，呈綠色熒光。（文獻(xiàn)來(lái)源：Sivandzade F et al. Analysis of the Mitochondrial Membrane Potential Using the Cationic JC-1 Dye as a Sensitive Fluorescent Probe. Bio Protoc. 2019 Jan 5;9(1). PMID: 30687773）

◇ Rhodamine 123, TMRM and TMRE

羅丹明123（貨號(hào)：NBS3208）普遍用做線粒體的結(jié)構(gòu)標(biāo)志物和線粒體活性的指示劑。

TMRM（貨號(hào)：NBS3231）和TMRE（貨號(hào)：NBS3230）分別是四甲基羅丹明的甲酯和乙酯形式，結(jié)構(gòu)非常類(lèi)似于羅丹明123。主要用作線粒體膜電位感應(yīng)器。與羅丹明123（貨號(hào)：NBS3208）一樣，這些陽(yáng)離子染料聚集在線粒體，由于自淬滅熒光減弱。TMRM（貨號(hào)：NBS3231）和TMRE（貨號(hào)：NBS3230）比羅丹明123能更快的穿過(guò)質(zhì)膜，它們的強(qiáng)熒光允許使用低濃度的探針，從而避免探針聚集。大鼠心肌細(xì)胞，TMRM（貨號(hào)：NBS3231）與X-rhod-1 AM同時(shí)使用共聚焦成像線粒體膜電位和鈣離子?；罴?xì)胞內(nèi)TMRE（貨號(hào)：NBS3230）成功用于高通量篩選影響線粒體膜電位的藥物。

◇ DiBAC（Bis-Oxonols）

三種雙巴比妥酸氧鎓醇，通常統(tǒng)稱(chēng)為DiBAC染料，形成一個(gè)光譜與眾不同的的電位探針家族，最大激發(fā)波長(zhǎng)約為490nm（DiBAC4(3) (貨號(hào)：NBS3220) ），530nm（DiSBAC2(3) (貨號(hào)：NBS3221)）和590nm（DiBAC4(5) (貨號(hào)：NBS3222) ）。有幾篇文章簡(jiǎn)單定義這些染料為雙氧鎓醇（bis-oxonol），則總是很難確定到底用的是哪一種染料。不過(guò)，大量使用雙氧鎓醇（bis-oxonol）的文章使用的主要為DiBAC4(3) (貨號(hào)：NBS3220)。

這些染料進(jìn)入去極化細(xì)胞，與胞內(nèi)蛋白或膜結(jié)合，表現(xiàn)處熒光增強(qiáng)和紅光遷移。去極化越高，內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞的陰離子染料越多，則熒光增加。相反，超極化隨之而來(lái)的是熒光降低（圖6）。與陽(yáng)離子碳菁類(lèi)染料相反，陰離子雙氧鎓醇大體被線粒體排斥，主要對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜電位敏感。DiBAC4(3) (貨號(hào)：NBS3220)產(chǎn)生的電位依賴(lài)熒光變化典型為~1%/mV。陰離子氧鎓醇和陽(yáng)離子K+-纈氨霉素復(fù)合體之間的相互作用使得在校準(zhǔn)電位反應(yīng)時(shí)用此離子載體變得復(fù)雜化。氧鎓醇類(lèi)染料對(duì)各種離子通道和受體呈現(xiàn)出已知的藥理活性。因此，在使用這些熒光探針的任何實(shí)驗(yàn)的情況下，都需要確定實(shí)驗(yàn)本身得到的生理效應(yīng)與外用加入探針濃度是無(wú)關(guān)聯(lián)的，這一步驟十分重要。

圖6. Detection of ATP-sensitive potassium (KATP) channel activation in isolated capillaries from guinea pig hearts using DiBAC4(3), a slow potentiometric probe. Application of a K+ channel opener (HOE 234) induced membrane hyperpolarization, resulting in a net efflux of intracellular DiBAC4(3), which is registered as a decrease of fluorescence intensity. These effects were reversed by subsequent treatment with the channel blocker glibenclamide.（文獻(xiàn)來(lái)源：Langheinrich U et al. Hyperpolarization of isolated capillaries from guinea-pig heart induced by K+ channel openers and glucose deprivation. J Physiol. 1997 Jul 15;502 ( Pt 2):397-408. PMID: 9263919）

2.3 慢速響應(yīng)探針特征和應(yīng)用匯總

2.5 慢速響應(yīng)探針產(chǎn)品信息

相關(guān)產(chǎn)品（電位探針校準(zhǔn)用）：