Cell-Tracker細胞示蹤/細胞追蹤熒光探針專題

（Cell-Tracker Fluorescent Probes）

背景需求：

細胞運動和定位研究需要專門的探針染料，首先必須要對活細胞無毒性，還要同時具有多種熒光顏色可供選擇，以便與不同的儀器激光波長和濾光片匹配并能與抗體標記或其他細胞分析標記探針共染色。

檢測細胞運動和定位的最簡單方法就是使用具有膜通透性的探針染料進入細胞并在加載后轉(zhuǎn)變?yōu)槟し峭ㄍ感缘漠a(chǎn)物。理想的細胞示蹤染料需要可存留于分裂多代后的子細胞中，但不會通過接觸轉(zhuǎn)移到相鄰細胞中。Cell-Tracker系列示蹤染料就是在這樣的背景下開發(fā)而來：在工作濃度下保持穩(wěn)定且無細胞毒性，可穩(wěn)定存留在細胞中，且在生理 pH 條件下可發(fā)出明亮的熒光。Cell-Tracker示蹤熒光染料還具有多種發(fā)射光譜，可輕松與抗體標記結(jié)合使用。

產(chǎn)品描述：

Cell-Tracker熒光探針是用來監(jiān)測細胞運動、定位、增殖、遷移、趨化和侵襲的優(yōu)秀工具。

Cell-Tracker熒光探針能自由穿透細胞膜進入細胞，在胞內(nèi)轉(zhuǎn)化生成不具細胞膜滲透性的反應(yīng)產(chǎn)物。Cell-Tracker熒光探針（除了Cell-Tracker Deep Red）含有一氯甲基或溴甲基基團，與巰基反應(yīng)，利用谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的催化作用。大多數(shù)細胞中谷胱甘肽含量很高（高達10mM），谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶普遍存在。Cell-Tracker Deep Red含一琥珀酰亞胺酯反應(yīng)基團，與蛋白上的胺基反應(yīng)。一旦轉(zhuǎn)化為不可逆產(chǎn)物，這些產(chǎn)物幾次傳代都能良好的保留在活細胞中。在細胞群內(nèi)，染料只會轉(zhuǎn)移到子代細胞，不會轉(zhuǎn)移到鄰近細胞。

Cell-Tracker探針特地設(shè)計使其至少72h（典型有3~6代）能展示熒光，此染料表現(xiàn)出理想的示蹤特征：穩(wěn)定、工作濃度下無毒性、良好保留在細胞，且在生理pH下呈明亮熒光。

重要特征：

① 可快速加載標記（通常 15 分鐘至 1 小時）

② 短期追蹤（一般 3-6代或72h）

③ 具有較強的耐光漂白/抗光淬滅特性

④ 熒光信號亮度適中

⑤ 信號分布于整個細胞

⑥ 適合熒光顯微鏡和HCS檢測

⑦ 提供多種發(fā)射光譜的Cell-tracker示蹤探針，適合多標實驗（見表1）。

表1. Cell-Tracker熒光探針的光譜特征

染色示例：

Fig 1. Co-culture of CellTracker? labelled fibroblasts (green) and hESMPs (red) on bilayer membranes of either PHBV–PLA or PHBV–PCL. （Ref.：Frazer J. Bye et al. Development of bilayer and trilayer nanofibrous/microfibrous scaffolds for regenerative medicine. Biomater. Sci., 2013, 1, 942-951.

Fig 2. Measuring O2 exchange in RBCs using single-cell O2-saturating imaging. (C) Wild-type RBCs loaded with a mixture of Deep-Red and Green, showing fluorescence in oxygenated and deoxygenated microstreams. （Ref.：Sarah L. Richardson, Alzbeta Hulikova, Melanie Proven, Ria Hipkiss, Magbor Akanni, Noémi B. A. Roy, Pawel Swietach. Single-cell O2 exchange imaging shows that cytoplasmic diffusion is a dominant barrier to efficient gas transport in red blood cells.Proceedings of the National Academy of Sciences May 2020, 117 (18) 10067-10078;）

訂購信息：

常見問題：

① 我的實驗需要做細胞遷移研究（約4h），需要對細胞做熒光標記，有推薦的產(chǎn)品?

比如：可選擇鈣黃綠素（Calcein AM，CAT NO. NBS2014）和二乙酸熒光素（FDA）（CAT NO. NBS0425）來做此用途。由于這些染料不會插入或共價結(jié)合到任何其它細胞成分，它們在胞內(nèi)的滯留時間比較短，因為某些細胞類型可能極其活躍的將染料泵出細胞。像Cell-Tracker系列染料，包含要么溫和巰基反應(yīng)的氯甲基基團要么胺基反應(yīng)的NHS基團，使得探針共價結(jié)合到細胞內(nèi)容物中，使得具更好的滯留效果。不管是哪種探針，用戶根據(jù)經(jīng)驗來確定在所用細胞類型內(nèi)的滯留時間。

② 我的實驗用Calcein AM來標記細胞，但第二天成像，發(fā)現(xiàn)沒有熒光信號，為什么？

鈣黃綠素（Calcein AM，CAT NO. NBS2014）是良好的細胞示蹤探針，以及常用的細胞質(zhì)染料。但，不會與胞內(nèi)內(nèi)含物結(jié)合，可能幾個小時就會被細胞泵出體外。鈣黃綠素在活細胞內(nèi)的滯留時間取決于不同細胞的內(nèi)在特征和培養(yǎng)條件。

如果要做長期成像，更推薦使用具反應(yīng)性的細胞質(zhì)染料比如：CFDA SE或Cell-tracker示蹤探針。

③我的實驗對兩種細胞染色，一種用Cell-tracker green，一種用Cell-tracker Red，但看起來紅色與綠色染色細胞間有交叉干擾，為什么？

一種可能性是染料間存在光譜滲透?？赏ㄟ^檢查單一染色細胞，比如：對于紅色染料標記細胞，用綠色熒光來檢測；對于綠色染料標記細胞用紅色熒光來檢測，用另一種顏色的對應(yīng)濾片來成像檢測。通過對這些對照的觀察，發(fā)現(xiàn)有光譜滲透，可通過降低染料標記濃度來降低染料亮度，或使用光譜間隔更大的染料重新標記。如果不存在光譜滲透，還有一種可能性是染色后細胞并未充分清洗，使得某些未插入的染料保留在新的染色體系內(nèi)進而標記上其它細胞。增加清洗次數(shù)和延長時間有可能改變這個問題。