NoninBio?基質(zhì)膠使用指南

 Part I 基質(zhì)膠——常識(shí)篇

1 、基質(zhì)膠分類？

基質(zhì)膠主要分為 5 大類（表 1），分別為標(biāo)準(zhǔn)型(Standard, STD)、細(xì)胞因子減少型(Growth Factor Reduced, GFR) 、高濃度型(High Concentration, HC) 、類器官專用型(Organoid)和干細(xì)胞專用 型（Embryonic Stem Cell, ESC）。

2 、應(yīng)該采購哪一款的基質(zhì)膠？

2. 1 標(biāo)準(zhǔn)型基質(zhì)膠適用于適用于極化細(xì)胞的培養(yǎng)，如上皮細(xì)胞。促進(jìn)多種類型細(xì)胞的分化， 包括肝細(xì)胞、神經(jīng)元、β-胰島細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。例如侵襲實(shí)驗(yàn)、 成管實(shí)驗(yàn)等。

2.2  細(xì)胞因子減少型基質(zhì)膠適用要求基質(zhì)膠成分相對(duì)明確的實(shí)驗(yàn)，例如類器官培養(yǎng)、血管生 成、干細(xì)胞培養(yǎng)等。

2.3  高濃度型基質(zhì)膠適用于體內(nèi)成瘤(CDX 、PDX)和體內(nèi)血管生成(Plug Assay)等。高濃度基 質(zhì)膠成膠速度快，凝膠剛性高，具有更好的支架效果(Cell Scaffold)。

2.4  類器官專用型基質(zhì)膠屬于細(xì)胞因子減少型亞類，有較高濃度和剛性，且通過小鼠小腸類 器官培養(yǎng)測(cè)試，能再現(xiàn)小腸類器官出芽表型和分子標(biāo)志物表達(dá)特征。

2.5  胚胎干細(xì)胞專用型基質(zhì)膠是經(jīng)驗(yàn)證具有特定培養(yǎng)基兼容性，且穩(wěn)定維持干細(xì)胞形狀和干 性的基質(zhì)膠。

表 1  基質(zhì)膠分類和應(yīng)用場(chǎng)景

NoninBio?基質(zhì)膠產(chǎn)品列表

3 、基質(zhì)膠保存、解凍、運(yùn)輸和分裝？

保存：基質(zhì)膠通常保存于-20 ℃的無除霜功能冰箱；

解凍：將基質(zhì)膠包裝瓶埋于碎冰中（僅暴露瓶口），置于 2-8℃冰箱過夜；

運(yùn)輸：干冰物流運(yùn)輸；

分裝：結(jié)合每輪實(shí)驗(yàn)基質(zhì)膠使用量進(jìn)行分裝，分裝后于-20 ℃的無除霜功能冰箱保存，避免 反復(fù)凍融。

4 、使用基質(zhì)膠前需要試劑和耗材預(yù)冷嗎？

由于基質(zhì)膠在高于 8 ℃的環(huán)境溫度下就會(huì)以不可逆形式聚合形成凝膠，所以在操作基質(zhì)膠過 程中，試劑（培養(yǎng)液、稀釋液、細(xì)胞懸液等）和耗材（吸頭、培養(yǎng)皿、EP 管和管架等）都 要求預(yù)冷，冰上操作。

5 、基質(zhì)膠顏色和狀態(tài)？

凍存狀態(tài)下，含酚紅基質(zhì)膠顏色通常為淺橘紅色，不含酚紅基質(zhì)膠呈現(xiàn)碎冰樣白色；解凍后， 含酚紅基質(zhì)膠紫紅色。解凍后不含酚紅高濃度基質(zhì)膠為半透明濃稠濁液，低濃度基質(zhì)膠為近 乎透明狀液體。

6、基質(zhì)膠出現(xiàn)沉淀怎么辦？

如發(fā)現(xiàn)基質(zhì)膠存在少量沉淀，建議 4 ℃低速離心后使用(5000 rpm for 5 min)，通常不影響基 質(zhì)膠活性。

7、包被培養(yǎng)皿時(shí)，基質(zhì)膠使用量？

表 2  基質(zhì)膠包被培養(yǎng)皿用量指導(dǎo)

Part II  基質(zhì)膠——實(shí)操篇

 1 、內(nèi)皮細(xì)胞血管生成實(shí)驗(yàn)(Tube Formation Assay)

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

血管形成實(shí)驗(yàn)是體外研究血管生成的經(jīng)典方法，該方法可快速確定調(diào)控血管生成的基因、 小分子或信號(hào)通路，結(jié)合鈣黃綠素(Calcein)染色和 Image J 分析工具，可以實(shí)現(xiàn)血管生成的  定量分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2. 1 包被：基質(zhì)膠解凍后，按照每孔 50-60 μl  的量加入預(yù)冷 96 孔板培養(yǎng)孔中(盡量避 免基質(zhì)膠產(chǎn)生氣泡) ，并輕輕搖晃培養(yǎng)板，使基質(zhì)膠均勻鋪于培養(yǎng)孔孔底；然后置于 37 ℃細(xì) 胞培養(yǎng)箱聚合 30 min。

1.2.2 細(xì)胞制備：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)中的 HUVEC 細(xì)胞消化，制備成 2E+5 cell/ml 懸液（計(jì) 數(shù)一定要準(zhǔn)確）。

1.2.3 接種：細(xì)胞混勻計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞接種至已報(bào)備培養(yǎng)孔中，每孔 100 μl ，輕輕搖勻 后，置于 37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 觀察：培養(yǎng) 6 h(或其他指定時(shí)間點(diǎn)）后，顯微鏡下觀察成管情況，同時(shí)采集照片。

1.3  注意事項(xiàng)

1.4.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)推薦使用標(biāo)準(zhǔn)型（貨號(hào): NBJ6234）或細(xì)胞因子減少型（貨 號(hào):NBJ6230）基質(zhì)膠，膠濃度為 8-10 mg/ml 最佳。

1.4.2 體外血管形成實(shí)驗(yàn)除了選好合適的基質(zhì)膠之外， 內(nèi)皮細(xì)胞的狀態(tài)也極為關(guān)鍵，建 議選擇 3-5 代次的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，鋪板接種前注意細(xì)胞狀態(tài)（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）并進(jìn)行饑餓培養(yǎng)。 同時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量不能過稀或者過密。

1.4 結(jié)果示例

2 、侵襲實(shí)驗(yàn)(Invasion)

2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)是體外模擬細(xì)胞主動(dòng)突破物理屏障發(fā)生位置轉(zhuǎn)移能力的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，被 廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力探索研究中，結(jié)合結(jié)晶紫染色可實(shí)現(xiàn)定量分析。應(yīng)用于炎 癥反應(yīng)、癌癥轉(zhuǎn)移、胚胎發(fā)育、血管生成、傷口愈合、免疫反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化等研究領(lǐng)域。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.2. 1 基質(zhì)膠稀釋：基質(zhì)膠解凍后，將基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基稀釋至 1 mg/ml 左右，混勻后 冰置于上備用。

2.2.2 小室鋪膠：按照每小室 60 μl 的量將稀釋后的基質(zhì)膠垂直加入預(yù)冷小室底部，不要產(chǎn)生 氣泡，然后置于 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育 2-3 h ，使基質(zhì)膠充分聚合為薄膜層。

2.2.3 基底膜水化：孵育后將小室中多余液體小心吸掉，加入 100 ul  無血清培養(yǎng)基，然后置 于 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育 30 min ，使基底膜充分水化。

2.2.4 檢漏：小心吸出小室中液體，檢查是否有液體穿過小室進(jìn)入下室中，若漏液則可用于 下游細(xì)胞接種（選做，非必須）。

2.2.5 細(xì)胞制備：消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期待檢測(cè)細(xì)胞，清洗后細(xì)胞重懸計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整至 1-10e+5 cell/ml（根據(jù)待測(cè)細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)弱調(diào)整細(xì)胞密度）；在 24 孔板下室加入 600 μl 含 5%-10% FBS 或趨化因子的培養(yǎng)基，然后用鑷子將 Transwell 小室置于 24 孔板內(nèi)，取適量 細(xì)胞懸液(100-200 μL)加入上室，最后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12-48 h（細(xì)胞量和時(shí)間視細(xì)胞侵襲 能力變化，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）；同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔，下室添加等體積無血清培養(yǎng)基。

2.2.6 固定：在指定時(shí)間點(diǎn)，取出 Transwell 小室，去除培養(yǎng)液，用 PBS 浸濕的棉簽或棉花輕 輕擦拭小室內(nèi)基質(zhì)膠和細(xì)胞。在 24 孔板干凈的孔中加入 600 μl 4%多聚甲醛固定液，將小室 放入固定 30 分鐘。然后棄固定液，PBS 洗滌小室內(nèi)外 1 次。

2.2.7 結(jié)晶紫染色：在 24 孔板干凈的孔中加入 600 uL 結(jié)晶紫染色液，將小室放入染色 10 分 鐘。

2.2.8 取出小室，PBS 洗滌小室內(nèi)外 3 次。適當(dāng)風(fēng)干后，顯微鏡下觀察定性研究；取 3-5 個(gè) 視野拍照。

2.2.9 定量分析：用 Image J 計(jì)數(shù)取平均值進(jìn)行定量研究。

2.3 注意事項(xiàng)

2.3. 1  根據(jù)細(xì)胞大小選擇合適的 Transwell chamber 小室，常用的為 8 μm 孔徑，細(xì)胞培養(yǎng)板 有 6- ，12-和 24-孔板等，最常用的是 24 孔板。

2.3.2  接種細(xì)胞狀態(tài)和密度非常關(guān)鍵，需結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)確定接種數(shù)量以及后續(xù)檢測(cè)固定染色時(shí) 間點(diǎn)。

2.4 結(jié)果示例

3 、皮下成瘤(Xenograft)

3.1  實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

       皮下成瘤實(shí)驗(yàn)為腫瘤發(fā)生發(fā)展研究和腫瘤藥物開發(fā)奠定了疾病模型基礎(chǔ)，被廣發(fā)應(yīng)用于各種 腫瘤發(fā)病機(jī)制研究。高濃度基質(zhì)膠有效促進(jìn)腫瘤形成，為腫瘤細(xì)胞提供合適的生長(zhǎng)微環(huán)境。

3.2  實(shí)驗(yàn)步驟

3.2. 1 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞匯合度達(dá) 80-90%左右為宜；

3.2.2 消化細(xì)胞后用預(yù)冷的 PBS 洗兩遍， 目的為去除細(xì)胞中殘余的血清和胰酶。

3.2.3 細(xì)胞用預(yù)冷 PBS 或無血清培養(yǎng)重懸，計(jì)數(shù)并根據(jù)需求調(diào)整細(xì)胞密度。細(xì)胞懸液與高濃 度基質(zhì)膠 1:1 混勻（如果細(xì)胞成瘤能力較高，基質(zhì)膠終濃度可以降低）。一般皮下瘤接種的 細(xì)胞量為 1-5×10^6 個(gè)細(xì)胞/鼠，接種體積為 0.1-0.2 ml。

3.2.4 裸鼠周齡 4-6 周齡，體重 16-18 g 左右，種植部位選擇血供豐富區(qū)域，如腋下中后部；

3.2.5 從進(jìn)針部位向前穿刺大約 1 cm ，進(jìn)行皮下注射，針頭在皮下左右滑動(dòng)幾次，以便細(xì)胞 接種成團(tuán)，避免注射后細(xì)胞懸液從針眼溢出；

3.2.6  接種后正常飼養(yǎng)，4-6 周成瘤，過程中檢測(cè)小鼠體重，腫瘤體積變化；最后取瘤進(jìn)行 拍照成像，保存組織用于下游實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

3.3  注意事項(xiàng)

3.3. 1  細(xì)胞與基質(zhì)膠混勻后，需置于冰上放置，并盡快注射，避免基質(zhì)膠聚合；同時(shí)低溫能 降低細(xì)胞代謝，維持細(xì)胞活力。

3.3.2  不同細(xì)胞成瘤能力也不同，所以細(xì)胞接種數(shù)量需結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳值。

3.3.3  稀釋后的基質(zhì)膠濃度不可低于 4 mg/ml。

3.4  結(jié)果示例

注：上排為加基質(zhì)膠組，下排為 PBS 對(duì)照組

4 基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)(Matrigel Plug Assay)

4.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)是體內(nèi)探究血管生成的一種技術(shù)，可用于分析調(diào)控血管生成的基因、小分 子或者信號(hào)通路，結(jié)合病理染色實(shí)驗(yàn)?zāi)軐?shí)現(xiàn)血管生成的定性和定量檢測(cè)。

4.2 實(shí)驗(yàn)步驟

4.2. 1  從-20℃或-80℃冰箱取出高濃度基質(zhì)膠，將其埋于碎冰之中，置于 4 ℃冰箱過夜 解凍。

4.2.2  將 EP 管、注射器、針頭、吸管等置于 4℃或冰上預(yù)冷，避免后續(xù)基質(zhì)膠操作過程 中提前聚合凝膠。

4.2.3  將 500 ul 高濃度基質(zhì)膠轉(zhuǎn)移至 1.5 ml EP 管中，并添加待測(cè)藥品（小分子化合物和 蛋白等），充分混勻后置于冰上。

4.2.4  麻醉小鼠（注射阿佛丁或其他吸入式麻醉）。麻醉后剃毛刀剃出小鼠身體一側(cè)待 注射位置毛發(fā)，酒精棉擦拭消毒備用。

4.2.5  在備皮處進(jìn)行皮下注射，注射時(shí)速度切記不要太快，慢慢推進(jìn)給藥；注射后 7-15d 形成基質(zhì)膠塞，并血管化。

4.2.6  血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉處死小鼠，取出基質(zhì)膠塞，置于 DMEM 中，去除基 質(zhì)膠塞表面粘附的其他組織，然后于 PBS 中再次清洗。

4.2.7  圖像采集與樣本保存：清洗干凈后拍照保存，膠塞的紅色程度代表血管生成的水 平；樣本保存后，可以用于病理染色分析血管形成的組織形態(tài)。

4.3 結(jié)果示例

Akhtar N, Dickerson EB, Auerbach R. The sponge/Matrigel angiogenesis assay[J]. Angiogenesis, 2002, 5: 75-80.

5 、類器官培養(yǎng)(Organoids)

5.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

利用臨床來源生物標(biāo)本的祖細(xì)胞或者干細(xì)胞株（例如 iPS ，ADSC 等）， 以基質(zhì)膠作為 三維立體培養(yǎng)支架(Scaffold)，在特定細(xì)胞因子作用下，體外誘導(dǎo)生成的類組織微球并定義為 類器官(Organoids)。其細(xì)胞分序組織結(jié)構(gòu)、遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性以及藥物反應(yīng)性與供體基本一致， 在新藥研發(fā)、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)科研等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值和前景。

5.2  實(shí)驗(yàn)步驟

5.2. 1  解凍：從-20℃或-80℃冰箱取出基質(zhì)膠，將其埋于碎冰之中(瓶扣朝上），并將冰盒置 于 4 ℃冰箱過夜解凍。

5.2.2  分裝：解凍后，輕輕搖勻基質(zhì)膠，并結(jié)合每次實(shí)驗(yàn)基質(zhì)膠需求量，分裝基質(zhì)膠，保留

1 管即用，其他的分裝后立即轉(zhuǎn)移至-20 ℃無除霜功能冰箱凍存（注：盡量放置到冰箱最深 處，避免冰箱門附近放置）。

5.2.3  細(xì)胞制備：組織樣本消化、制備單細(xì)胞懸液以及計(jì)數(shù)（略）。

5.2.4  穹頂制備：將細(xì)胞沉淀（冰上預(yù)冷）用基質(zhì)膠重懸并混勻（膠：細(xì)胞懸液比值大于等 于 1.5），進(jìn)行點(diǎn)膠(Dome)，點(diǎn)膠完成后，將培養(yǎng)板倒扣轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱，37 ℃孵育 15-30 min； 然后添加適量已預(yù)熱的完全培養(yǎng)基（緩慢輕柔），置于 37 ℃ , 5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)， 每天觀察類器官生長(zhǎng)情況，結(jié)合類器官數(shù)量等安排換液（換液時(shí)培養(yǎng)基提前預(yù)熱）、傳代或 者凍存。

5.3  結(jié)果示例

6 、干細(xì)胞培養(yǎng)(Stem cell)

6.1  實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

干細(xì)胞（Stem cell）是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，例如 iPSC ，ESC 等。通 常干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)需要血清和/或胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的加持，但是該方法后續(xù)篩選工作耗 時(shí)，且實(shí)驗(yàn)再現(xiàn)性和一致性相對(duì)較差?；|(zhì)膠作為干細(xì)胞培養(yǎng)包被基質(zhì)，一定程度上降低了 干細(xì)胞培養(yǎng)的繁瑣性，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有更好的再現(xiàn)性和一致性。

6.2  實(shí)驗(yàn)步驟（以 iPSC 為例）

6.2. 1  解凍：從-20 ℃或-80℃冰箱取出基質(zhì)膠，將其埋于碎冰之中(瓶扣朝上），并將冰盒置 于 4 ℃冰箱過夜解凍。

6.2.2  分裝：解凍后，輕輕搖勻基質(zhì)膠，并結(jié)合每次實(shí)驗(yàn)基質(zhì)膠需求量，分裝基質(zhì)膠，保留

1 管即用，其他的分裝后立即轉(zhuǎn)移至-20 ℃無除霜功能冰箱凍存（注：盡量放置到冰箱最深 處，避免冰箱門附近放置）。

6.2.3  稀釋：將基質(zhì)膠按照預(yù)定比例用預(yù)冷 DMEM/F12 稀釋（具體稀釋比例需結(jié)合基質(zhì)膠濃 度和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，通常稀釋倍數(shù)在 50-100 之間）。

6.2.4  包被：將稀釋后的基質(zhì)加入 6 孔培養(yǎng)板(1 mL/孔)或 100 mm 培養(yǎng)皿(8 mL/培養(yǎng)皿) 。在 使用前請(qǐng)將培養(yǎng)皿在室溫下(37 ℃)孵育 2 小時(shí)，待基質(zhì)膠聚合后，使用前小心吸出培養(yǎng)皿中 剩余的液體，盡量避免刮擦培養(yǎng)表面。

6.2.5  接種：將制備好的 iPSC 細(xì)胞懸液接種到包被后的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻細(xì)胞， 于 37 ℃ , 5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)并每天更換培養(yǎng)基。

6.3  結(jié)果示例